Как культивировать клетки кожи

Обновлено: 22.04.2024

Для цитирования: Таха Т.В., Нажмутдинова Д.К. Клеточные технологии в косметологии и дерматологии. РМЖ. 2013;22:1092.

Развитие и внедрение ряда новейших методик и нанотехнологий определяет будущее развитие медицины на несколько лет вперед.

О стволовых клетках науке известно давно. Первым о существовании стволовых клеток заявил русский ученый А.А. Максимов. Термин «стволовая клетка» он предложил еще в 1908 г., чтобы объяснить механизм быстрого самообновления клеток крови, и выступил с новой теорией кроветворения в Берлине на съезде гематологов.
В 1999 г. журнал «Science» признал открытие эмбриональных стволовых клеток третьим по значимости событием в биологии после расшифровки двойной спирали ДНК и программы «Геном человека». Уже исходя из одного этого факта, можно сделать вывод о том, насколько клеточные технологии важны для развития медицинской науки и практики.
Лечение стволовыми клетками в России разрешено. В соответствии с требованиями Росздравнадзора, клиники должны быть сертифицированы по так называемому стандарту ИСО 9001. В нашей стране, тем не менее, существует достаточно большое количество крио- и гемобанков, которые, имея лицензии только на размножение и хранение стволовых клеток, предлагают еще и лечение. На сайте Росздравнадзора в разделе «Клеточные технологии» можно без труда обнаружить пакет документов каждой конкретной клиники и определить, обладает ли эта клиника всеми лицензиями, сертификатами и разрешениями, необходимыми не только для работы со стволовыми клетками, но и для применения их в медицинской практике.
Клеточные технологии – один из самых перспективных и в то же время спорных «горячих» вопросов современной биологии и медицины.
Стволовые клетки есть у каждого из нас. Легче всего стволовые клетки обнаружить и выделить у молодых людей и у детей. Но и у людей старшего возраста они есть, правда, в гораздо меньшем количестве (для сравнения: у человека в возрасте 60–70 лет на 5–8 млн клеток одна стволовая, у эмбриона одна на десять тысяч).
По виду стволовые клетки подразделяются на гемопоэтические (способные трансформироваться только в клетки крови) и мезенхимальные (возникшие из зародышевого листка мезенхимы и являющиеся прародителями практически всех типов клеток).
По способу пролиферации стволовые клетки подразделяются на следующие группы:
1. Тотипотентные – обладают максимальной способностью к делению и превращению в любую клетку организма, и теоретически не исключается, что при встрече с раковой клеткой они могут принять и ее форму и спровоцировать развитие онкологического заболевания (однако на сегодняшний день имеется ряд исследований американских ученых, доказывающих, что если эти стволовые клетки и вызывают опухоли, то только доброкачественные). Данные клетки обнаруживаются только в тканях эмбриона на первой неделе жизни и в абортивном материале того же срока.
2. Плюрипотентные клетки – способность к делению ниже, и эти клетки обладают определенной дифференцировкой.
3. Мультипотентные зрелые мезенхимальные клетки – потенциал к делению у них ниже, чем у двух предыдущих групп, однако эти клетки четко дифференцируются в клетки и ткани пораженного органа. Это – «умные» клетки: они могут трансформироваться только в полнофункциональные морфологически полноценные клетки любой ткани организма. Такие зрелые клетки можно найти в плаценте рожденного плода.
В самом начале работы по изучению возможностей клеточных технологий использовались стволовые клетки эмбриона или фетальных тканей (полученных из материалов при прерывании беременности), т.е. тотипотентные. По этическим моментам и по характеристике, данной этим клеткам выше, в настоящее время они не используются в лечении.
Клиники, специализирующиеся на клеточных технологиях, применяют только третью группу клеток –мезенхимальные зрелые стволовые клетки: они менее активны, дифференцируются только в полноценные клетки пораженных тканей и органов. Именно мезенхимальные стволовые клетки показали самую высокую универсальность и эффективность как перспективное клеточное сырье для выращивания органов. К примеру, японские ученые 42 детям с пороками развития сосудов грудной полости пересадили артерии, выращенные из их собственных стволовых клеток, а в Германии (Мюнхен) научная группа под руководством доктора Содиана достигла значительных успехов в выращивании из стволовых клеток клапанов сердца. В 2008 г. в Испании была выполнена сенсационная операция – 30-летней женщине пересадили участок трахеи, выращенный из собственных стволовых клеток, а в 2010 г. аналогичную операцию провели британскому мальчику.
Процедура клеточной терапии мезенхимальными стволовыми клетками включает 3 этапа:
• забор биологического материала (жировая ткань или костный мозг) под местной анестезией;
• культивирование клеток и получение чистой клеточной культуры (около 200 млн клеток);
• введение полученной клеточной массы внутривенно (в виде обычной капельницы) или в комплексе с мезотерапевтическим (внутрикожным) введением в область поврежденных участков тела.
Мезенхимальные стволовые клетки получают либо из биологического материала самого пациента (жировой ткани или его костного мозга), либо из ткани плаценты здоровых новорожденных детей (в этом случае клетки являются донорскими). Введение донорских клеток происходит у следующей группы лиц: несовершеннолетние больные (до 18 лет), пожилые люди старше 60 лет, пациенты с хроническими инфекционными заболеваниями либо с системными дегенеративными процессами неинфекционной природы, а также лица, долгое время подвергающиеся интоксикации. Противопоказаниями для применения клеточной терапии являются:
• беременность;
• онкологические заболевания, независимо от срока давности;
• наличие ВИЧ-инфекции;
• заболевания, обусловливающие необходимость постоянного приема антибиотиков и гормонов.
Стволовые клетки культивируются в специальных пластмассовых емкостях в условиях инкубации путем пересадки из одной питательной белковой среды в другую, на каждой стадии происходит удаление продуктов распада, очищение и промывание клеточной культуры. В чистой культуре получается до 200 млн клеток, такой большой объем вводится в связи с тем, что печень и легкие забирают огромное количество клеток для возобновления собственной ткани.
Эстетическая медицина, дерматология, косметология активно используют клеточные технологии в борьбе с возрастными изменениями кожи, алопецией, посттравматическими рубцами. Официально разрешено применение стволовых клеток для лечения стрий, возрастных изменений, выпадения волос, ожогов, хронических ран (разрешение ФС № 2011/002 от 03 февраля 2011 г.).
Введение стволовых клеток помогает при облысении (алопеции). Но только в том случае, если потеря волос вызвана не гормональными причинами, а недостаточным кровоснабжением волосяных луковиц. Тогда мезенхимальные стволовые клетки стимулируют рост нервных окончаний, новых сосудов, и рост волос восстанавливается.
Стволовые клетки устраняют кожную пигментацию, рубцы, последствия воздействия химических веществ, лазера. Исчезают морщины, пятна после акне, улучшается тонус кожи.
Известно, что старение кожи, в частности снижение ее тургора и эластичности, во многом обусловлено снижением количества юных и зрелых фибробластов. В молодой коже содержится большое число функционально активных фибробластов, которые обеспечивают постоянное обновление и пополнение коллагеновых волокон и гликозаминогликанового геля, – основных структурных компонентов межклеточного вещества кожи. В процессе старения кожи существенно замедляются обновление межклеточного вещества дермы, синтез коллагена и гликозаминогликанов. В результате истончается дермальный слой кожи, она теряет влагу, что постепенно приводит к снижению ее упругости и эластичности. Основываясь на этих наблюдениях, были предложены подходы с использованием аутологичных фибробластов кожи, аутологичных мезенхимальных стволовых клеток, выделенных из жировой ткани, или аллогенных мезенхимальных стволовых клеток, выделенных из плаценты/пуповины с целью устранения признаков старения кожи. Основной принцип омоложения кожи аутологичными фибробластами заключается в следующем: доставить в стареющую кожу более активно функционирующие молодые клетки, которые способны синтезировать коллаген и гликозаминогликаны. К сожалению, аутологичные фибробласты обладают невысоким пролиферативным потенциалом, особенно культуры этих клеток, выделенные из кожи пожилых доноров. С этой точки зрения, для достижения максимально возможного ревитализирующего эффекта необходимо использовать более «молодые» клетки, коими являются мезенхимальные стволовые клетки, выделенные из плаценты/пуповины или жировой ткани. Так, было показано, что после проведения сеанса мезотерапии по устранению признаков старения кожи с использованием клеточного материала на основе мезенхимальных стволовых клеток, выделенных из плаценты/пуповины человека, эластичность кожи повышалась на 15–26%, а эффект сохранялся в течение 3–8 мес. в зависимости от возраста пациента и исходного состояния кожи. Многочисленные проведенные клинические исследования по ревитализации кожного покрова с использованием стволовых клеток показали, что интрадермальное введение клеточного материала является безопасным, стимулирует микроциркуляцию, эластичность кожи и улучшает ее структуру.
Когда на коже образуются морщины, теряется ее упругость, это лишь внешние изменения – те, которые мы видим. Но старение затрагивает и внутренние органы, которым также требуется обновление. Ревитализация рассчитана не только на стирание морщин и подтягивание кожи, но и на восстановление организма в целом. Стволовые клетки не творят чудес, которых ожидают от любой процедуры омоложения. После их введения не произойдет моментальной подтяжки лица и устранения глубоких мимических морщин. Этот материал работает по-иному, подстегивая организм к восстановлению за счет собственных ресурсов. Он помогает обновлению на клеточном уровне, которое в молодом возрасте происходит без постороннего вмешательства. Позднее требуется помощь, которую и оказывают стволовые клетки. Добавление к процедуре внутривенного введения мезенхимальных стволовых клеток дважды с интервалом в 2 мес. местного обкалывания проблемных зон приводит к ревитализации, т.е. омоложению всего организма и, как следствие, к более длительному и выраженному омолаживающему эффекту, который оценивается не ранее, чем через полгода после окончания курса лечения.
Интерес в косметологии представляет и совместная направленная деятельность пластических хирургов и клиник, занимающихся клеточными технологиями во время процедуры липосакции, т.к. аутожир, – один из источников мезенхимальных стволовых клеток, и возможно было бы осуществление забора материала во время этой процедуры.
Введение стволовых клеток – это не обычная методика, не салонная процедура, а часть медицинской косметологии, поэтому она должна проводиться строго в условиях специализированной клиники с хорошей репутацией. Наилучший возраст, приемлемый для процедуры омоложения – от 35–40 лет.
Процедура лечения мезенхимальными стволовыми клетками с фармакоэкономической точки зрения – дорогостоящая процедура, но она включает в себя забор материла, культивирование, хранение, очистку, введение клеток. Подход к клеточной терапии должен быть не только как к «лечению стволовыми клетками», но и как к лечению собственных клеток организма, что позволяет не только обособленно влиять на определенные зоны тела, но и повысить функциональную активность всего организма и оптимизировать процессы естественной регуляции жизнедеятельности, что, как следствие, отразится на продлении молодости и способности пациента к долгому активному комфортному образу жизни.

Литература
1. Skin ageing and its treatment. L. Baumann; J. Pathol., 2007; Vol. 211, P. 241–251.
2. Stem Cell Facelift. Introducing the «Stem Cell Facelift» Complete Facial Rejuvenation offers a Cost-Effective Alternative to Surgery.
3. The Stem Cell Facelift. Plastic Surgery Practice, May 2009, Richard Ellenbogen discusses the revolution taking place in rejuvenation techniques.
4. Wognum A.W., Eaves A.C., Thomas T.E. Identification and isolation of hematopoietic stem cells // Arch Med Res. 2003; Vol. 34(6): P. 461–75.
5. Mohle R., Rafii S., Moore M.A. The role of endothelium in the regulation of hematopoietic stem cell migration // Stem Cells. 1998; Vol.16 Suppl 1: P.159–65.
6. Moore M.A. Stem cell proliferation: ex vivo and in vivo observations // Stem Cells. 1997; Vol.15 (Suppl 1): P. 239–48
7. Ashrjian P.H., DeUgarte D.A., Katz A.J., Hedrick M.H. Lipoplasty: From Body Contouring to Tissue Engineering // Aesthetic Surgery Journal, 2002, Vol. 22, N 2. P. 121–130.
8. Rubin J.P., Agha-Mohammadi S. Mesenchymal Stem Cells: Aesthetic Applications // Aesthetic Surgery Journal, 2003, Vol. 23, N 6. P. 504–506.

Контент доступен под лицензией Creative Commons «Attribution» («Атрибуция») 4.0 Всемирная.

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова», Владивосток, Россия

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова», Владивосток, Россия, 690087;
Дальневосточный Федеральный университет, Владивосток, Россия, 690091

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова», Владивосток, Россия, 690087

Культура клеток HeLa: бессмертное наследие Генриетты Лакс

Журнал: Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2019;37(4): 151‑157

Используя в лабораторных исследованиях клеточные культуры, мы часто не задумываемся об истории их происхождения, интересной и поучительной, а порой трагичной. В 50-е годы ХХ века в большую науку неожиданно пришла культура клеток HeLa, которая стала одной из самых известных. Эти клетки были взяты у женщины по имени Генриетта Лакс (Henrietta Lacks), у которой был рак шейки матки, и вскоре после этого она умерла, а клеточная линия HeLa оказалась незаменимым инструментом для нескольких поколений ученых всего мира при разработке новых видов лечения и в биомедицинских исследованиях. Уникальность этих клеток состоит в их «бессмертии», способности бесконечно делиться, неприхотливости в культивировании и приспособленности к условиям консервации, при этом они остаются упрощенной имитацией человеческого организма.

Введение

Одним из важнейших достижений экспериментальной биологии нашего века стало создание методов культивирования клеток животных и растений in vitro. С помощью этого метода клетки самых разно-образных тканей человека можно выращивать на специально подобранных питательных средах, подобно бактериям или другим одноклеточным организмам. Множество клеточных культур человека изначально было получено из клеток раковых опухолей. Эти клетки могут делиться в культуре неограниченное число раз, и поэтому их называют бессмертными (immortalitate). Ученые долгое время были уверены, что как in vitro, так и in vivo бесконечно долго могут делиться и нормальные клетки человека.

Однако в начале 60-х годов XX века профессор анатомии Калифорнийского университета Леонард Хейфлик (Leonard Hayflick) открыл ограничение числа делений у нормальных диплоидных клеток человека в клеточной культуре: приблизительно после 50 делений выявляются признаки старения (senescence), а при достижении данной границы они погибают («предел Хейфлика») [1]. Этот феномен сильно зависит от возраста индивидуума, которому такие клетки изначально принадлежали: клетки новорожденных делились в культуре до 80—90 раз, а у 70-летнего человека — только 20—30 раз. Количество делений зависит от длины теломеров — концевых участков хромосом, выполняющих защитную функцию. Таким образом, теломеры не только защищают хромосомы от деградации и слияния, но и в зависимости от своей длины определяют потенциальную кратность деления клетки. Исходная длина теломерных ДНК человека составляет от 2—20 тыс. нуклеотидных пар (н.п.). При каждом клеточном делении длина теломеров нормальных клеток сокращается на 50—60 н.п. В 1984 г. Кэрол Грайдер выделил фермент, который синтезирует (удлиняет) теломерную ДНК. Этот фермент был назван теломеразой. Искусственная индукция экспрессии гена каталитического компонента теломеразы (при помощи методов генной инженерии) делает клеточную культуру бессмертной, т. е. способной делиться неограниченно долго, отменяя тем самым для этой культуры «предел Хейфлика» [2, 3].

При разработке новых видов лечения в биомедицинских исследованиях учеными часто используются культуры человеческих клеток, выращенные в лабораторных условиях. Среди множества клеточных линий одной из самых известных является HeLa — культура клеток эндотелия матки Генриетты Лакс (Henrietta Lacks). Эти клетки, адекватно имитирующие упрощенный человеческий организм в лабораторных условиях, представляют собой хороший пример бессмертия раковых клеток [4, 5].

Полученные в 1951 г. несколько опухолевых клеток делятся по сей день, переносят десятки лет замороженное состояние, поделены на части в разных пропорциях. На своей поверхности они несут достаточно универсальный набор рецепторов, что позволяет использовать их для исследования действия различных цитокинов; они очень неприхотливы в культивировании; хорошо переносят консервацию. За эти годы произведены тонны этих клеток, и все они являются «потомками» клеток опухоли Г. Лакс.

В большую науку эти клетки попали совершенно неожиданно. Они были взяты у женщины по имени Генриетта Лакс (Henrietta Lacks), которая вскоре после этого умерла, однако клеточная популяция убившей ее опухоли осталась жить. Все предыдущие попытки получить культуры клеток из опухолевых тканей вне организма человека заканчивались не-удачей: после определенного количества делений вся клеточная линия погибала [5].

Уникальность этой клеточной линии, названной в честь Генриетты «HeLa», состояла в том, что in vitro они размножались вдвое быстрее клеток из нормальных тканей, при полностью отключенной внутриклеточной программе подавления роста. Клеточная культура HeLa стала первой, и в течение многих лет остается единственным и незаменимым инструментом для нескольких поколений ученых. В результате ученые получили первую стабильную и бессмертную клеточную культуру, что обеспечило ей статус одной из самых популярных линий клеток, используемых в научных изысканиях. Это открывает небывалые перспективы для исследований в молекулярной и клеточной биологии, медицине и фармакологии.

Генриетта Лакс

Красивая чернокожая американка Генриетта Лакс (рис. 1),

Рис. 1. Генриетта Лакс, фото S. Gilgenkrantz [5]. потомок белых плантаторов и их черных рабов, одна из дочерей в семье с десятком детей, проживала в небольшом городке Тернер в Южной Вирджинии вместе с мужем и 5 детьми. 1 февраля 1951 г. Генриетта Лакс поступила в гинекологическое отделение госпиталя Дж. Хопкинса: ее беспокоили странные кровянистые выделения в межменструальном периоде. При осмотре была обнаружена 23 см опухоль шейки матки. После проведения биопсии был выставлен диагноз: «эпидермальная карцинома шейки матки». Восемь месяцев спустя, несмотря на оперативное лечение и радиационную терапию, в возрасте 31 года она умерла [4, 5].

В ходе обследования лечащий врач отправил биопсию ее опухоли на анализ Джорджу Гею (George Gey), руководителю лаборатории исследования клеток и тканей при университете Джонса Хопкинса (Балтимор, Штат Мэриленд), который занимался проблемой лечения рака и поиском бессмертной клеточной линии человека для научных исследований (рис. 2).

Рис. 2. Джордж Отто Гей George Otto Gey (1899—1970), фото S. Gilgenkrantz [5]. Он первым открыл необыкновенные свойства этих опухолевых клеток, которым было суждено стать первой человеческой культурой. Ему удалось выделить одну конкретную клетку, нарастить ее и начать клеточную линию. Он запустил процесс размножения клеток Лакс, создав бессмертную клеточную линию, в отличие от нормальных популяций клеток, имеющих «предел Хейфлика». Вскоре Джордж Гей обнаружил, что клетки HeLa способны пережить даже пересылку по почте, и разослал их своим коллегам по всей стране. Очень скоро спрос на клетки HeLa вырос, и их растиражировали в лабораториях по всему миру. Они стали первой в мире стандартной клеточной линией, которая пролиферировала необычайно быстро и была более устойчивой даже в сравнении с другими раковыми клетками [5].

1 сентября 1951 г. Джордж Гей, держа в руках пробирку с клеточной культурой HeLa, выступал перед телевизионными камерами. Он заявил, что благодаря полученной клеточной линии в медико-биологических научных исследованиях началась новая эпоха, открывающая невиданные перспективы в разработке новых лекарственных препаратов и что не далек тот день, когда будет найдено лекарство от рака. Генриетта Лакс умерла в госпитале Хопкинса 4 октября 1951 г., а популяция ее клеток продолжала свой безудержный рост, значительно опережая развитие биоэтических норм и правил, необходимых для регулирования научного прогресса.

Почему ее клетки так важны?

В отличие от обычной популяции человеческих клеток, которые делятся от 40 до 50 раз, прежде чем умереть, клетки HeLa способны делиться бесконечно.

Нормальные клетки человека имеют кариотип, состоящий из 46 хромосом, в то время как клетки HeLa — от 76 до 80 хромосом, в значительной степени мутированных [6]. Появление этого отклонения от нормального кариотипа связано с вирусом папилломы человека (ВПЧ) HPV18, ответственного почти за все случаи рака шейки матки. ВПЧ «вставляет» свою ДНК в клетку-хозяина, в результате чего она начинает синтезировать протеин, который связывается и инактивирует белок p53, известный как хранитель генома из-за его роли в пред-отвращении мутации и подавлении опухоли. Поэтому инактивация белка р53 может иметь катастрофические последствия [7].

Даже по сравнению с другими раковыми клетками клетки HeLa растут чрезвычайно быстро. В свое время доктор Дж. Гей был поражен, увидев, что в течение 24 ч культивирования своего первого образца HeLa количество клеток удвоилось. Причиной этой аномалии служит активность фермента теломеразы HeLa. Так, в процессе деления нормальной клетки повторяющиеся короткие последовательности ДНК на концах всех хромосом, известные как теломеры, сокращаются вследствие снижения активности данного фермента [8]. Это приводит к старению и, в конечном счете, к апоптозу и гибели клеток. Нормальные клетки имеют максимальное количество делений прежде, чем эти теломеры истощаются. А в клетках HeLa, за счет высокой активности теломеразы, теломеры удлиняются, достигая при этом неограниченной репликативной возможности [9]. Эта аномалия позволяет клеткам HeLa делиться бесконечно, что делает их сейчас старше возраста Генриетты на момент ее смерти.

Этой клеточной культуре ученый мир обязан многими замечательными достижениями. Например, без клеток HeLa была бы невозможна разработка в 1953 г. вирусологом Национального фонда детского паралича Джонасом Солком (Jonas Salk) вакцины против полиомиелита из инактивированных вирусов [4]. Это был большой и многообещающий научный успех, но прежде чем применять новый препарат на людях, его необходимо было испытать на живых человеческих клетках. Популяция клеток HeLa оказалась совершенным инструментом. Они не только быстро росли, что позволяло своевременно накопить огромное количество клеток, необходимых для исследования, но и, как оказалось, легко заражались вирусом полиомиелита. Менее чем за 1 год вакцина была готова для применения на пациентах [10].

После успешного использования клеток HeLa для получения вакцины вируса полиомиелита линии культур клеток человека стали незаменимыми для выделения и культивирования ряда других вирусов, производства антител, интерферона, противоопухолевых химиопрепаратов. С тех пор список прорывных технологий и достижений с использованием клеток HeLa стал постоянно пополняться. Они повсе-дневно используются для вирусологических исследований, изучения таких заболеваний, как рак, СПИД, для оценки воздействия радиации и токсичных веществ, составления генетических карт, развития методов клеточной инженерии и решения огромного количества других научных задач [5].

В конце 60-х годов XX века НеLa и другие клеточные культуры дали толчок для возникновения генетической инженерии (условно относят к 1972 г.), когда в США П. Бергом (Paul Naim Berg) и его коллегами из Стэнфордского университета была создана первая рекомбинантная молекула ДНК. Открылась возможность целенаправленно конструировать искусственные генетические программы и многие нужные лекарственные препараты [11].

В декабре 1960 г. клетки HeLa полетели в космос на советском космическом аппарате «Спутник-6», в последующем они побывали в космосе еще несколько раз. Результаты показали, что HeLa хорошо себя чувствуют не только в земных условиях, но и в невесомости. С тех пор HeLa применяли для клонирования (в том числе знаменитой овечки Долли), многочисленных генетических исследований, отработки методов искусственного оплодотворения и для тысяч других исследований. С 1972 г. эти клетки активно используются в международной программе совместной борьбы с раком, при участии медиков всего мира [5].

Благодаря клеткам HeLa была выявлена связь ВПЧ и раком шейки матки, а также роль теломеразы в пред-отвращении деградации хромосом. За это Харальд цур Хаузен в 2008 г. и Элизабет Блэкберн, Кэрол Грейдер и Джек Шостак в 2011 г. были удостоены двух Нобелевских премий [12, 13].

«Мать вирусологии, клеточных и тканевых технологий, биотехнологии, современной медицины» — вот далеко не полный перечень эпитетов, которые заслужила за многие десятилетия эта клеточная культура.

Таким образом, невольный вклад Генриетты Лакс в медицину бесценен, за более чем полувековое служение науке и человечеству клеточная культура HeLa стала неоценимой и неотъемлемой частью биомедицинских исследований (рис. 3).

Рис. 3. История использования клеток в молекулярной биологии и медицине (рисунок авторов).

А тем временем…

А тем временем личность самой Генриетты Лакс долгое время не афишировалась. Доктор Гей, конечно, знал о происхождении клеток HeLa, но он считал, что конфиденциальность в этом вопросе является приоритетной, и в течение многих лет никто, и в том числе семья Лакс, не знал, что это именно ее клетки прославились на весь мир [5].

Хотелось бы отметить, что некоторыми учеными клетки HeLa были вынесены в отдельный вид, не относящийся к человеческому — Helacyton gartleri (Hela, в честь самих клеток HeLa; cyton, от греческого цитоса, что означает клетка; и gartleri — в честь генетика Стэнли Гартлера, который первым задокументировал поразительные свойства этих клеток). Эволюционный биолог Ли Ван Вален относит клетки HeLa к новому микробному виду из-за их не-ограниченного деления, собственного клонального кариотипа, хромосомной несовместимости с людьми, разной экологической ниши и способности выживания вне человеческого тела. Однако многие с этим не согласны, так как считают выживание клеток HeLa искусственным явлением и утверждают, что эволюция в чашке Петри мало влияет на эволюцию в природе [17]. В парках, скверах и городах, созданных людьми, живет большое количество микро- и макроорганизмов, адаптированных к этим условиям, добавляет Ван Вален. Так, человеком были искусственно созданы новые виды, хотя и не от своей собственной плоти. Если бы HeLa не был получен из человеческой ткани, утверждает Ван Вален, не было бы никаких сомнений в том, что его выделили бы в новый вид [18, 19].

Тем не менее образец раковой опухоли, ради любопытства помещенный в питательную среду, стал быстро размножаться, не стареет, и вот уже 65 лет активно используется в науке. В наше время клеточная культура HeLa — это важный научный инструмент многих исследовательских лабораторий, благодаря ему были проведены тысячи исследований, защищены диссертации, опубликованы более 70 тыс. научных статей и получены более 11 тыс. патентов. На сегодняшний день их настолько много, что если бы Генриетта была жива, то их вес в общем количестве в десятки раз превысил бы вес самой женщины, которая, к сожалению, так и не узнала о том, какой бесценный, хоть и невольный вклад она внесла в науку.

Поэтому хочется почтить память Генриетты Лакс. Ее клетки — оставшееся после нее бессмертное наследие, спасли и продолжают спасать жизней больше, чем в силах сделать любой врач.

Современные методы трансплантации культивированных клеток кожи и её эквивалентов при лечении ожогов

Алексеев А.А.
Попов С.В.

Одной из главных проблем лечения больных с обширной ожоговой травмой является закрытие раневых поверхностей. Новые возможности для ее решения появились вместе с разработкой механического перфоратора «Meshdermatom» (J.C.Tanner et al., 1964), позволяющeго наносить насечки на аутодермотрансплантат с получением параллельных отверстий одинаковой длины и ровными кожными промежутками. Величина такого трансплантата с коэффициентом перфораций 1:4 при его растяжении в 2-3 раза превосходит первоначальную. В дальнейшем были разработаны другие вариантыи модификации перфораторов.

Однако при обширных глубоких ожогах более 30-40 % поверхности тела закрыть все ожоговые раны при помощи лишь одних перфорированных аутодермотрансплантатов невозможно из-за дефицита донорских ресурсов (С.И.Киселев 1971; Е.Н.Матчин 1975; В.Рудковский с соавт., 1980; В.А.Огольцова 1982; B.J.MacMillan 1982).

В связи с этим разработка альтернативных методов закрытия обширных ожоговых поверхностей остается одним из актуальных вопросов комбустиологии.

Принципиальная возможность использования для заживления ран аутоклеток кожи, выращенных in vitro была показана ещё в сороковых годах в работах профессора зоологии Лондонского университета P.R.Medawar. Однако длительное время исследователям не удавалось получить многослойные пласты аутоклеток, достаточные по площади, способные реально заменить аутодермотрансплантат.

Лишь в середине семидесятых J.Rheinwald и H.Green (1975, 1977) удалось разработать метод культивирования клеток эпидермиса — кератиноцитов, позволяющий в течение примерно 3-х недель получить из биоптата кожи в 3-4 см2 многослойный пласт кератиноцитов в 1000 или даже 10000 раз превышающий первоначальный размер биоптата. В 1980 году Banks-Shlegel и H.Green опубликовали результаты трансплантации культивированных кератиноцитов человека бестимусным мышам, продемонстрировавшие перспективность выбранного направления. О первом клиническом применении аутокератиноцитов, культивированных по методу J.Rheinwald и H.Green у людей сообщил N.E.O’Connor с соавторами в 1981 году в журнале «Lancet». (N.E.O’Connor, J.B.Mulletkin et al. 1981). В статье сообщалось об успешном лечении двух больных с ожогами 80 % и 40 % поверхности тела. Метод лечения заключался в хирургической некрэктомии, временном закрытии образовавшихся ран трупной кожей и трансплантации на раневую поверхность через три недели культивированных аутокератиноцитов. В дальнейшем метод стал внедрятся в клиническую практику ведущих ожоговых центров развитых стран мира (G.G.Gallico, N.E.O’Connor et al., 1984; G.G.Gallico, N.E.O’Connor et al., 1985; S.A.Carney, 1986; M.Kumagai et al., 1988; A.Eldad et al., 1987; M.De Luca et al., 1989; С.Ф.Малахов c соавт.,1993).

Имеющиеся недостатки явились причиной дальнейшого научного поиска и исследований. Перспективным направлением оказалось использование аллогенных кератиноцитов. Работы J.M.Hefton с соавторами (J.M.Hefton, J.V.Amberson et al. 1981) и V.B.Morhenn с соавторами (V.B.Morhenn, C.V.Benike et al. 1982) показали, что кератиноциты, подвергшиеся культивированию не активизируют главный комплекс гистосовместимости, который как известно вызывает наиболее выраженную реакцию отторжения аллоклеток. Основываясь на полученных данных J.M.Hefton c cоавторами (Hefton J.M., Finkelstein J., Madden M.R., Shires G.T., 1983) провели первую успешную трансплантацию культивированных аллогенных кератиноцитов трем пациентам с дермальными ожогами. Метод позволял закрывать раны не дожидаясь трехнедельного срока, необходимого для получения подложек с культивированными аутокератиноцитами, а также создавать банки аллогенных клеток. В дальнейшем транспланатция аллогенных кератиноцитов вошла в клиническую практику некоторых ожоговых центров в развитых странах мира (M.R.Madden, J.L.Finkelstein et al., 1986; A. Eldad et al., 1987; R.Fratianne, F.Papay et al. 1993; P.Brychta P. et al., 1995; Z.Dedoviс et al., 1998; С.Ф.Малахов с соавт., 1996; С.В.Смирнов с соавт., 1998). Накопленный клинический опыт показал, что оптимальные результаты получаются при трансплантации аллокератиноцитов на дермальные ожоги и донорские раны с частично сохранившимся эпителием, существенно укорочивая сроки их заживления. Трансплантации на полнослойные раны были менее удачны и повидимому не являются методом выбора при их лечении. Результаты проведенных исследований, направленных на изучение дальнейшей судьбы аллогенных кератиноцитов (V.Gielen, M.Faure, et al., 1987; K.Hancock, M.E.Hackett 1989), в частности при помощи фингерпринтинга ДНК (A.E.Vaan der Merwe et al. 1990) показали, что со временем они элиминируются и постепенно замещаются аутоклетками. На конференции Европейского сообщества по эквивалентам кожи в Лионе в 1989 году была принята общая концепция, согласно которой аллокератиноциты рассматривают как временную биологическую повязку, производящую экстрацеллюлярный матрикс и стимулирующую пролиферацию собственного эпителия больного.

Отсуствие дермы при глубоких ожогах обусловило разработку методов её восстановления, поскольку трансплантация культивированных аутологичных и аллогенных кератиноцитов не решает этой задачи. Для её решения в настоящее время наметилось два основных направления — использование аллогенной дермы и создания аналога дермы в условиях in vitro.

Аллогенную кожу трупов для временного закрытия обширных глубоких ожогов используют в комбустиологии с 1953 года (J.B.Brown, M.P.Fryer et al. 1953). О возможности постоянного закрытия глубоких ожоговых ран аллогенной кожей, лишенной эпидермиса, было сообщено в 1985 году E.L.Heck с соавторами (E.L.Heck et al. 1985). Основываясь на полученных данных C.Cuono с соавторами в 1986 году (C.Cuono et al., 1986) провели первую успешную трансплантацию культивированных аутокератиноцитов на аллодерму. В своей работе они использовали трупную кожу, прошедшую криообработку, которая накладывалась на раны после хирургической некрэктомии глубоких ожогов. После подготовки подложек с культивированными аутокератиноцитами эпидермис трупной кожи удалялся, а на оставшуюся аллогенную дерму переносили подложки с культивированными аутокератиноцитами. и R.L.Sheridan и R.G.Tompkins (1995) сообщают о приблизительно равной площади лизиса аутокератиноцитов, трансплантированных на трупную дерму и непосредственно на раневую поверхность у больных с обширными ожогами. И в том и в другом случае лизис пересаженных культивированных кератиноцитов составил в среднем 49 % от площади трансплантации.

В последующем для уменьшения иммунореактивности аллогенной дермы был предложен её бесклеточный вариант. В результате специальной обработки аллодерма утрачивала клетки, но сохраняла свою внеклеточную структуру — естественно расположеные коллагенновые волокна, базальную мембрану и др. Один из вариантов её применения предполагает имплантацию ацеллюлярной дермы на полнослойные ожоговые раны с одновременной аутодермопластикой сверху тонким кожным трансплантатом (A.S.Livesy, D.N.Herndon et al., 1995; Wainwright D.J. 1995; V.Lattari, L.M.Jones et al., 1997). В других работах проводилось культивирование кератиноцитов на сосочковом слое бесклеточной дермы с созданием исскуственного аналога полнослойной кожи (D.A.Medalie , R.G.Tompkins et al., 1996; H.O.Rennekampff, О. V.Kiessig et.al. 1997). Во всех проведенных исследованиях отмечалось проникновение в трансплантированную ацеллюлярную дерму фибробластов, эндотелиальных клеток, прорастание сосудов со стороны раневого ложа по направлению их естественного хода. Толщина такой «неодермы» превышала толщину «неодермы» после традиционной аутодермопластики. Имеются публикации сообщающие о одновременном культивировании кератиноцитов на сосочковом слое аллодермы и фибробластов на её нижней поверхности (E.Matouskova et al., 1993; M.M.Ghosh, S.Boyce et. al., 1997). Однако клинический опыт применения бесклеточной дермы в настоящее время невелик и не позволяет сделать окончательных выводов о её преимуществе перед другими методами восстановления полнослойных дефектов кожи. Так, чешские исследователи E.Matouskova и соавторы (1994, 1997) на основании собственных клинических наблюдений с применением аналога кожи, состоящего из ацеллюлярной свиной дермы и культивированных кератиноцитов человека (RHPS-recombined human/pig skin) у больных с глубокими ожогами и донорскими ранами считают, что бесклеточную ксенодерму можно использовать только как носитель культивированных клеток, перемещаемый на рану вверх дном, то есть, с предлежанием культивированных кератиноцитов непосредственно к раневой поверхности.

Вторым направлением для восстановления дермы при глубоких ожогах стало создание биополимерных покрытий. Одна из наиболее известных моделей, предложеная J.F.Burke и I.V.Yannas (1981), получившая название искусственной кожи (artificial skin), состояла из двух слоев, верхнего — тонкой силиконовой пленки и нижнего, представляющего собой биодеградирующую пористую мембрану из перекрестно связанного коллагена и хондроитин-6-сульфата. Исскуственная кожа накладывалась на раны, образующиеся в результате хирургической некрэктомии глубоких ожогов. В течение двух-трех недель в поры нижнего слоя проникали фибробласты и эндотелиталиальные клетки больного, прорастали сосуды, одновременнно с этим происходила биодеградация самого нижнего слоя, состоящего их коллагена и хондроитин-6-сульфата. В результате чего образовывалась ткань более похожая на дерму, чем на рубец (J.F.Burke 1981). После образования «неодермы» верхний силиконовый слой удалялся и производилась аутодермопластика тонким трансплантатом толщиной примерно 0,1 мм. Использование такого тонкого трансплантата обусловливало быструю эпителизацию донорских ран и позволяло брать повторно трансплантаты с одного и того же места с небольшими интервалами (Yannas I.V., Burke J.F. et al. 1982). Следует отметить, что клинические результаты использования «исскуственной кожи» при лечении 106 обожженных в нескольких ожоговых центрах США показали более высокий уровень её лизиса в сравнении с традиционной аутодермопластикой — в среднем 20 % и 5 % соответственно. Хотя косметические результаты в случаях её приживления исследователями были оценены как несколько лучшие (D.Heimbach, A.Luterman, J.F.Burke et al. 1988).

J.Hansbrough, S.Boyce (1988) предложили свой вариант клеточно-биополимерного покрытия. Предложенный авторами культивированный заменитель кожи (cultured skin substitut), представлял собой пористую биодеградирующую мембрану, состоящую из перекрестно связанных коллагена и хондроитин-6-сульфата, на верхней поверхности которой, лишенной пор, культивировали кератиноциты и затем после получения монослоя культуры в таком виде переносили на раны, образовавшиеся в результате хирургической некрэктомии глубоких ожогов. Следующий вариант покрытия (J.Hansbrough, S.Boyce 1989) был дополнен культивированием фибробластов на нижней поверхности мембраны. В другой работе культивированные кератиноциты на верхней поверхности были заменены тонким аутодермотрансплантатом (J.Hansbrough, 1992). Однако при клиническом применении лизис таких покрытий был выше по сравнению с традиционной аутодермопластикой (S.T.Boyce, M.J.Goretsky, Greenhalgh et al. 1995).

Группа исследователей из Массачусетского технологического института и Гарвардской медицинской школы (E.Bell, H.P.Ehrlich et al. 1981) разработали так называемый «живой эквивалент кожи» (living skin equivalent), представляющий собой коллагеновый гель, включающий культивированные фибробласты, сверху покрытый культурой кератиноцитов. Имеются как положительные так и критические отзывы в литературе, описывающие клинический опыт применения «живого эквивалента кожи» (J.Nanchahal, R.Dover, W.R.Otto, S.K.Dhital 1989; D.Wasserman, et. al. 1988).

Причинами не всегда удачных результатов использования покрытий, содержащих коллаген по мнению ряда авторов (В.П.Туманов 1996; D.Wasserman et.al., 1988; M.Koide, K.Osaki et al. 1993; Matsuda et al. 1997) являются: снижение пролиферативной активности фибробластов, находящихся в контакте с коллагеном; повышение уровня синтеза коллагеназ; неустойчивость такого рода искусственных покрытий к воздействию ферментов и инфекции.

Одним из существенных недостатков применения культивированных аутокератиноцитов является длительный срок их приготовления, занимающий в среднем три недели. Для сокращения срока подготовки клеточных культур предложены методы выращивания кератиноцитов непосредственно на носителях, которые затем перемещают на рану. Такой технологический прием позволяет «уйти» от травматичного этапа классической методики по J.Rheinwald и H.Green — отделения пласта культуры кератиноцитов ферментом диспазой перед её переносом на подложки, во время которого по данным H.Green может повреждаться до 50 % базальных клеток культуры. Кроме того, предполагается, что носители стимулируют пролиферацию культивированных кератиноцитов на раневой поверхности. Эти обстоятельства позволяют сократить срок подготовки к трансплантации по сравнению с классическим методом. В качестве носителей предложены: коллагенновые подложки (M.J.Morykwas, T.R.Stevenson, C.L.Marcelo et al. 1989), фибриновый гель (H.W.Kaiser, G.B.Stark, J.Kopp et. al. 1994; Spilker G., Reifenrath M.W., Kaiser H.W. 1996), подложки, состоящие из композиций коллагена, гликозаминогликанов и хитозана (P.Y.Gueugniaud, A.Fabreguette, L.Oddou et al., 1997), на основе гиалуроновой кислоты (S.R.Myers, J.Grady et al. 1997) и др. Предложено также использование микроносителей (С.Ф.Малахов с соавт., 1997, С..В.Смирнов с соавт., 1998; J.Hecht, E.A.Hoefter et al., 1997). Однако для окончательных выводов о эффективности этих методов необходимо дальнейшее накопление и изучение клинического опыта.

В Институте хирургии им.А.В.Вишневского РАМН разработан и внедрен в клиническую практику новый метод лечения обширных ран у обожженных, принципиально отличающийся от ранее предложенных, основанный на использовании культуры аллогенных фибробластов (Д.С.Саркисов, В.П.Туманов с соавт., 1990; В.Д.Федоров, Д.С.Саркисов с соавт., 1993; Д.С.Саркисов, А.А.Алексеев с соавт., 1994). Предпосылкой к его разработке стали предшествовашие фундаментальные исследования регенераторного процесса, показавшие ключевую роль в нем фибробластов (В.В.Серов, А.Б.Шехтер, 1982; Е.А.Ефимов 1984; Л.И.Бобро 1990; B.Coulomb, L.Dubertret et. al., 1984; B.Coulomb, P.Satag, et al. 1986), а также установившие факт частичной потери фибробластами поверхностных антигенов гистосовместимости в процессе культивирования (P.Хэй 1989; J.Nanchahal, et al. 1989).

Патогенетический механизм действия предложенного метода заключается в синтезе аллогенными фиброластами экстрацеллюлярного матрикса, факторов роста, стимуляции пролиферации собственного эпителия, направленных на восстановление как эпидермального так и дермального компонента кожи. При ожогах IIIА степени, донорских и длительно незаживающих ранах трансплантацию 3-х дневной культуры аллофибробластов осуществляют непосредственно на подготовленные в результате комплексного лечения раны. При глубоких ожогах IIIB-IV степени трансплантацию аллофибробластов сочетают с аутодермопластикой с коэффициентом расширения 1:6 и более. В последнем случае аллофибробласты стимулируют эпителизацию ячеек аутотрансплантата.

Накопленный клинический опыт в различных ожоговых центрах и отделениях (А.А.Алексеев, А.Ю.Яшин 1996; А.А.Алексеев, Д.А.Саркисов с соавт., 1997; С.И.Воздвиженский, Л.И.Будкевич с соавт., 1996; Матчин Е.Н., Потапов В.Л., Огольцова В.А. 1996; Д.Я.Алейник, В.А.Аминев с соавт. 1998; Н.М.Кузнецов, О.Н.Мазка с соавт. 1998), показал его высокую эффективность. Преимуществами метода являются — небольшие сроки культивирования аллофибробластами (3 суток), хорошее приживление трансплантатов (в среднем 97 %), возможность создания банка аллогенных клеток, относительно небольшая себестоимость.

Таким образом, разработка методов лечения с использованием культивированных клеток кожи и её эквивалентов уже привела к значительному прогрессу и расширению возможностей оказания помощи обожженным, вместе с тем научный поиск оптимальных методов восстановления дермы и эпидермиса продолжается, оставаясь актуальной проблемой в комбустиологии.

Организм человека можно спокойно сравнивать с очень сложным и порой запутанным механизмом, к которому не прилагалась инструкция, посему ученым приходится самим во всем разбираться. В нашем теле много систем, от нервной до иммунной, каждая из которых выполняет свои определенные функции и связывается с другими системами, что позволяет организму эффективно функционировать. В научно-исследовательском сообществе львиная доля внимания приходится на нервную систему. Всех тянет раскрыть секреты нашего мозга, который так часто сравнивают по загадочности с Вселенной. Но другие системы не менее интересны, сложны и важны. Сегодня мы с вами рассмотрим исследование, объединившее в себе математику, биохимию и много любопытства. А целью сего исследования является эпидермис, то бишь кожа человека. Как математика помогла ученым понять чего им не хватало в процессе выращивания кожи и что у них получилось в результате? На эти и другие вопросы мы попытаемся ответить с помощью доклада исследовательской группы. Поехали.

Пожизненная «броня»

Кожа человека не так проста, как может показаться на первый взгляд. Кто-то может считать ее просто оболочкой, а кто-то и вовсе «мешком для костей». Но оставим в сторонке высказывания самого аморального робота в мире по имени Бендер и углубимся в структуру кожи человека.

Во-первых, кожа это самый большой орган человеческого тела (других существ не будем затрагивать, учитывая рассматриваемое исследование), состоящий из трех основных подсистем: эпидермис (внешний слой), дерма (соединительная ткань между верхним слоем кожи и органами) и подкожно-жировая клетчатка (терморегулирующий и защитный слой с функцией «хранилища» питательных веществ).

Строение кожи человека.

Поскольку в исследовании ученые «колдуют» над эпидермисом, мы рассмотрим этот слой подробнее.

Эпидермис человека, если вы одинаково любите анатомию и кулинарию, напоминает торт Наполеон, ибо состоит из пяти слоев. В каждом из слоев имеются клетки, которые являются главными «испытуемыми» в рассматриваемом нами исследовании — кератиноциты. В эпидермисе они вообще занимают львиную долю — порядка 90% от всех клеток.

Функции кератиноцитов разнятся в зависимости от принадлежности к определенному слою:

базальный — самый близкий к дерме слой, в котором такие клетки как кератиноциты именуются базальными, что вполне логично. Эти клетки в сопряжении со стволовыми занимаются важным процессом — регенерацией эпидермиса. Также в цитоплазме кератиноцитов имеются меланосомы — гранулы меланина, полученные от меланоцитов (клеток), которые защищают нас от воздействия ультрафиолетового излучения.
шиповатый слой получил свое колючее название за счет необычной структуры клеток кератиноцитов, имеющих шипообразные отростки для соединения друг с другом. В цитоплазме местных кератиноцитов происходит синтез кератина, участвующего в формировании волос и ногтей. С биологической точки зрения, кератин уступает по физической прочности только хитину. Помимо этого тут есть и кератиносомы, которые делают нашу кожу гидрофобной.
зернистый слой — кератиноциты также обладают кератиносомами, то есть препятствуют обезвоживанию кожи. Также кератиноциты в данном слое синтезируют некоторые белки.
блестящий слой назван так, поскольку при микроскопии не выявляются клетки, а сам слой похож на однородную полоску розового цвета. Так оно и есть — ядра, органеллы и межклеточные соединения кератиноцитов в данном слое разрушаются. При этом имеется вещество, связывающее кератиноциты (или то, что от них осталось). Это делает кожу прочной.
роговой — наружный слой эпидермиса, контактирующий с окружающей средой. А еще его можно назвать самым настоящим клеточным кладбищем, ибо образован он из мертвых кератиноцитов (именуемых роговыми чешуйками), которые постоянно обновляются. Это обеспечивает эффективную защиту от внешних факторов.

Клетка кератиноцита

Стоит также упомянуть и тот факт, что кератиноциты участвуют и в заживлении ран. При повреждении кожи клетки кератиноцитов начинают активно делиться и мигрировать к области травмы, где происходит эпителизация, то есть ранка начинает зарастать.

Как мы можем понять по этим слоям, кератиноцитов много и они выполняют разные функции, когда работают совместно с клетками другого типа. Универсальные солдаты среди клеток эпидермиса, никак иначе.

В чем же проблема исследования, спросите вы? А в том, что нормальный слой эпидермиса человека примерно 100 мкм в толщину, а вот искусственный (созданный посредством пассирования кератиноцитов) всего лишь 10 мкм.

Пассирование клеток* — отбор необходимого числа клеток для их дальнейшего выращивания на субстрате (например, в чашке Петри).

Такой эпидермис попросту будет неэффективен, как танк из папье-маше. И вот тут может помочь математика, а именно математическая модель. О ней и поговорим далее.

Основа исследования

Ученые и раньше использовали математические модели в качестве основы процесса создания человеческого эпидермиса. В данном же исследовании была разработана новая методика эпидермального гомеостаза, в основе которой лежит именно математическая модель распределяемых в базальном слое кератиноцитов, полученных из стволовых клеток. Стоит отметить, что в модели также учитывались динамические процессы в эпидермисе (миграция и дифференцировка клеток кожи) и внутриклеточные процессы, связанные с Ca 2+ .

Данная математическая модель позволила понять, что важнейшую роль в синтезе эпидермиса необходимой толщины и структуры играет распределение стволовых клеток и структура базальных мембран, отделяющих соединительную ткань от эпителия.

Если же более конкретно говорить о таком показателе как толщина, то именно базальные мембраны играют главную роль. Для достижения необходимого результата ученые применили синусоидальную модуляцию для формы базальной мембраны, изменяя амплитуду и длину волны. В результате чего было обнаружено, что для стабильной структуры эпидермиса необходимой толщины требуется волнистые базальные мембраны с большой амплитудой и короткой длиной волны. То есть волнообразность папиллярного слоя, расположенного над дермой и под эпидермисом, является критически важной для создания модели эпидермиса, приближенной к реальным физиологическим показателям.

Помимо толщины и прочности кожа человека обладает еще и гидрофобностью, которая зависит от толщины рогового слоя. Соответственно, толщина этого слоя также должна учитываться в экспериментальной модели для более реалистичного воссоздания эпидермиса.

Объединив все желаемое и необходимое, ученые спроектировали модель для демонстрации возможности создания приближенного к реальности эпидермиса, включающего в себя роговой слой и межклеточную пластинчатую липидную структуру. Реализация всего этого осуществлялась путем посева пассированных кератиноцитов на волнистой поверхности полиэфирной основы в открытых чашках Петри.

Результаты были весьма успешны, чем подтвердили не только полноценность и корректность данного метода выращивания, но и важность использования математических моделей, как инструментов прогнозирования процессов.

Результаты исследования

Изображение №1

На изображениях выше показаны результаты моделирования и результаты выращивания эпидермиса на основе этого моделирования.

Исследователи обращают наше внимание на два очень показательных изображения (1А и 1В). В первом случае имеется плоская базальная мембрана, во втором — синусоидальная, которая и позволила увеличить толщину и прочность эпидермиса.

Но это лишь модель, хоть и с очень заманчивыми результатами, для получения которых необходимо установить какие параметры должна иметь основа для посева (полиэфир). Для этого была проанализирована структура паппилярного слоя, толщина которого у человека составляет 51 мкм, а интервал «волнистости» — 105 мкм (анализировалась кожа на брюшной полости, средний возраст участников исследования — 36.3 года).

Коротенький вывод — волнообразная основа для посева приводит к увеличению числа живых клеток эпидермиса и к его утолщению и уплотнению, что приближает выращенный образец по показателям к реальному человеком эпидермису.

Изображение №2

Филаггрин (2А), лорикрин (2В) и ZO-1 (2С) были экспрессированы в верхнем слое эпидермиса. А экспрессия клаудина 1 прошла в клеточной мембране по всей плоскости эпидермиса (2D).

Обратите внимание на изображение 2G, на котором черной стрелкой и знаком «*» отмечен определенный слой — роговой. Это говорит о том, что данный синтезированный эпидермис имеет хорошие защитные (от внешних факторов) характеристики.

Изображение №3

Исследователи также проверили белок CSPG4, который играет очень важную роль во взаимодействии клетки и субстрата. Анализ показал наличие данных клеток на волокнах основы (3D, белые стрелки), что говорит о наличии на волокнах клеток, часть которых имеет пролиферирующие свойства.

Следующим испытуемым стал белок YAP, который участвует в регуляции транскрипции (синтеза РНК в клетках за счет ДНК). В контрольном образце YAP был локализован исключительно на базальном слое (3Е). А вот в тестовом образце YAP присутствовал вокруг волокон (3F, красные стрелки).

Применение малых интерферирующих РНК в процессе анализа активности белка YAP привел к дестабилизации трехмерной структуры (3G и 3H).

В контрольном образце с применением малых интерферирующих РНК белок YAP был экспрессирован вокруг волокон (3I), а в тестовом образце экспрессия была незначительна (3J). Но, несмотря на это, применение малых интерферирующих РНК никак не повлияло на пролиферацию кератиноцитов.

Для более детального ознакомления с нюансами и подробностями исследования настоятельно рекомендую заглянуть в доклад исследовательской группы и дополнительные материалы к нему.

Данное исследование совместило в себе биохимию и математику. Конечно, эти две науки очень часто ходят парой, если ученые намерены получить достоверные и адекватные результаты. Применение математического моделирования в данном случае помогло понять важность волнообразности основы для выращивания эпидермиса, что значительно увеличивает число живых клеток и, как следствие, толщину и прочность образца.

Сей труд по большей степени был нацелен на проверку работоспособности именно математической модели, а не самой техники выращивания эпидермиса. Те трудности, с которыми сталкивались исследователи ранее, более не будут мешать им продолжать более детальное изучение способов синтеза клеток и выращивания эпидермиса в таком виде, который будет максимально приближен к реальному.

Результаты этого труда вполне могут в дальнейшем стать достаточно важным шагом вперед как для трансплантологии, так и для исследований кожи человека в целом, а также подтолкнуть других исследователей более активно применять математическое моделирование как инструмент первоочередной важности.

Благодарю за внимание, оставайтесь любопытствующими и отличной всем рабочей недели, ребята.

Спасибо, что остаётесь с нами. Вам нравятся наши статьи? Хотите видеть больше интересных материалов? Поддержите нас оформив заказ или порекомендовав знакомым, 30% скидка для пользователей Хабра на уникальный аналог entry-level серверов, который был придуман нами для Вас: Вся правда о VPS (KVM) E5-2650 v4 (6 Cores) 10GB DDR4 240GB SSD 1Gbps от $20 или как правильно делить сервер? (доступны варианты с RAID1 и RAID10, до 24 ядер и до 40GB DDR4).

VPS (KVM) E5-2650 v4 (6 Cores) 10GB DDR4 240GB SSD 1Gbps до весны бесплатно при оплате на срок от полугода, заказать можно тут.

Читайте также: