Факторы роста при регенерации кожи

Обновлено: 28.03.2024

1 ФГБОУ ВО «Приволжский исследовательский медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

В работе представлено сравнительное исследование содержания факторов роста (PDGF – ВВ, VEGF- А, TGF-β, FGFb) в сыворотке и тромбоцитарном лизате (ТЛ) условно здоровых доноров и пациентов с ожоговой травмой различной площади. ТЛ получали методом холодового шока. Для определения содержания факторов роста в сыворотке и ТЛ использовали метод иммуноферментного анализа. Показано, что содержание факторов роста (PDGF-BB, VEGF-A, TGF-β, FGFb) у здоровых и пациентов с ожоговой травмой подвержено значительным колебаниям при преобладании содержания протеинов в ТЛ по сравнению с таковым в сыворотке. Не фиксируется статистически значимого изменения PDGF-ВВ, VEGF-A и TGF-β в ТЛ у пациентов с ожоговой болезнью при поступлении в стационар по сравнению с уровнем этих протеинов у условно здоровых добровольцев. В процессе лечения ожоговой болезни отмечаются достоверные изменения уровня факторов роста в ТЛ и сыворотке. Максимальное содержание факторов роста (PDGF-ВВ, VEGF-A, TGF-β) в ТЛ и сыворотке определяется в период с 10 по 20 день после ожога. В этот период содержание FGFb в сыворотке и ТЛ пострадавших с ожоговой травмой достоверно отличается от такового у здоровых добровольцев. Отсутствие изменений количественного содержания основных факторов роста в ТЛ пациентов с ожоговой травмой по сравнению с таковым в ТЛ здоровых свидетельствует о сохранении продукции этих протеинов, несмотря на тяжесть патологического процесса.


1. Blair P., Flaumenhaft R. Platelet alpha-granules: basic biology and clinical correlates // Blood reviews. – 2009. – Vol. 23. – P. 177–189.

2. Marx R. Plateler-rich plasma: evidence to support its use // Journal of oral and maxillofacial surgery. – 2004. – Vol. 62. – P. 489–496.

3. Hemeda H., Giebel B., Wagner W. Evaluation of human platelet lysate versus fetal bovine serum for culture of mesenchymal stromal cells // Cytotherapy. – 2014. – Vol. 16. – P. 170–180.

4. Lopez-Vidriero E., Goulding K.A., Simon D.A., Sanchez M., Johnson D.H. The use of platelet-rich plasma in arthroscopy and sports medicine: optimizing the healing environment // Artroscopy. – 2010. – Vol. 26. – № 2. – P. 269–278.

5. Stellos K., Kopf S., Paul A., Marquardt J.U., Gawaz M., Huard J., Langer H.F. Platelets in regeneration // Seminars in Thrombosis and Hemostasis. – 2010. – Vol. 36. – № 2. – P. 175–184.

6. Lange C., Cakiroglu F., Spiess A.-N., Cappallo-Obermann H., Dierlamm J., Zander AR. Accelerated and safe expansion of human mesenchymal stromal cells in animal serum-free medium for transplantation and regenerative medicine // J. Cell. Phys. – 2007. – Vol. 213. – P. 18–26.

7. Mishra A.K., Skrepnik N.V., Edwards S.G., Jones G.L., Sampson S., Vermillion D.A., Ramsey M.L., Karli D.C., Rettig A.C. Efficacy of plateletrich plasma for chronic tennis elbow: a double-blind, prospective, multicenter, randomized controlled trial of 230 patients // Am J. Sports Med. – 2014. – Vol.42. – P. 463–471.

8. De Pascale M.R., Sommese L., Casamassimi A., Napoli C. Platelet Derivatives in Regenerative Medicine: An Update. Transfus Med. Rev. – 2015. – Vol. 29. – P. 52–61.

9. Stacey M.C., Mata S.D., Trengove N.J., Mather C.A. Randomised doubleblind placebo controlled trial of topical autologous platelet lysate in venous ulcer healing // Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. – 2000. – Vol. 20. – P. 296–301.

10. Al-Ajlouni J., Awidi A., Samara O., Al-Najar M., Tarwanah E., Saleh M., Awidi M., Hassan F.A., Samih M., Bener A., Dweik M. Safety and Efficacy of Autologous Intra-articular Platelet Lysates in Early and Intermediate Knee Osteoarthrosis in Humans: A Prospective Open-Label Study // Clin. J. Sport. Med. – 2015. – Vol. 25. – № 6. – P. 524–528.

11. Стимуляция регенераторных процессов в хронических ранах с помощью богатой тромбоцитами аутоплазмы: клинико-экспериментальное исследование / В.Н. Оболенский [и др.] // Клин. и эксперимент. хир. Журн. им. акад. Б.В. Петровского. – 2016. – № 1. – С. 38–43.

12. Roos E., Marck M.D., Kim L.M., Gardien K.L.M., Stekelenburg C.M, Vehmeijer M., Baas D., Tuinebreijer W.E., Breederveld R.S., Middelkoop E. The application of platelet-rich plasma in the treatment of deep dermal burns: A randomized, duble-blind, intra-patient controlled study // Wound Repair and Regeneration J. – 2016. – Vol. 24. – № 4. – P. 712–720.

13. Suthar M., Gupta S., Bukhari S., Ponemone V. Treatment of chronic non-healing ulcers using autologous platelet –rich plasma: a case series // J. of Biomedical Science. – 2017. – Vol. 24. – № 16. – P. 1–9.

14. Парамонов Б.А., Порембский Я.О., Яблонский В.Г. Ожоги. Руководство для врачей. – СПб.: Спец. Лит, 2000. – 480 с.

15. Шанский Я. Лизат тромбоцитов человека, как ростовая добавка для культивирования различных типов клеток: автореф. дис. … канд. мед. наук. – Москва, 2016. – 17 с.

16. Lathrop B., Thomas K., Glaser L. Control of myogeni C differentiation by fibroblastgrow1h factor is mediated by position In the Gl phase of the cell cycle // Cell Bioi. – 1985. – Vol. 101. – P. 2194–2198.

17. Lanz T.V., Opit C.A., Ho P.P., Agrawal A., Lutz C., Weller M., Mellor A.L., Steinman L., Wick W., Platten M. Mouse mesenchymal stem cells suppress antigen-specific TH cell immunity independent of indoleamine 2,3-dioxygenase 1 (IDO1) // Stem Cells Dev. – 2010. – Vol. 19. I. 5. – P. 657–668.

Биологически активные молекулы: цитокины и факторы роста – играют ключевую роль в регуляции процессов восстановления тканей после повреждения. Активация и оптимальное использование эндогенных биоактивных молекул является важнейшей задачей регенеративной медицины. Одним из возможных источников факторов роста в организме при патологических процессах может быть фракция тромбоцитов или продукты на их основе.

Cтруктура и функции тромбоцитов подробно изучены и освещены в литературе. Известно, что в α-гранулах тромбоцитов содержится комплекс биологически активных протеинов – факторов роста [1–3]. Среди них для регенерации кожи важнейшее значение имеют тромбоцитарный фактор роста (PDGF), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF-А), трансформирующий фактор роста (TGF-β), фактор роста фибробластов (FGF) и некоторые другие [2–5]. В сложном каскаде молекулярных событий, который обеспечивает процесс регенерации тканей после повреждения, участвуют все указанные протеины, а их функции дополняют и на каких-то этапах дублируют друг друга. Каждый из факторов роста характеризуется плейотропным действием, т.е. имеет много мишеней. Эффекты воздействия факторов на разные клетки-мишени могут различаться, что определяется как самой клеткой мишенью, так и наличием и соотношением других факторов роста, их синергическим действием. В α-гранулах тромбоцитов кроме факторов роста содержатся и другие активные молекулы: остеокальцин, остеонектин, фибриноген, фибронектин, витронектин, тромбоспондин-1, цитокины, хемокины, металллопротеазы, фунгицидные белки, факторы коагуляции [6].

Накопление данных о биологически активных веществах, содержащихся в α-гранулах тромбоцитов, послужило основанием для клинического применения продуктов на основе тромбоцитов. Такими продуктами в первую очередь стала обогащенная тромбоцитами плазма [7, 8] и тромбоцитарный лизат – ТЛ [9, 10]. Положительный эффект применения обогащенной тромбоцитами плазмы отмечен при длительно незаживающих ранах, трофических язвах, травматических повреждениях кожного покрова и некоторых других патологиях покровных и мягких тканей [11–13].

Активация процессов регенерации с использованием продуктов на основе тромбоцитов при таких сложных и тяжелых поражениях, каковыми являются ожоги, имела бы существенное значение. Хорошо известно, что течение ожоговой болезни сопровождается угнетением и нарушением функций всех органов и систем организма, в том числе и системы кроветворения. Поэтому нельзя исключить снижение содержания тех или иных факторов роста в тромбоцитах и, как следствие, в сыворотке пациентов с ожоговой травмой, что может влиять на процесс заживления ожоговой раны. Для понимания этого вопроса необходимо исследование изменений основных факторов роста у пациентов с ожоговыми поражениями.

Цель работы: провести сравнительное исследование содержания основных факторов роста (PDGF-ВВ, VEGF-А, FGFb, TGF-β) в ТЛ и сыворотке пациентов с ожоговой болезнью и условно здоровых добровольцев.

Материалы и методы исследования

Материалом для исследования служили сыворотка и ТЛ периферической крови восемнадцати условно здоровых добровольцев и 31 пациента с ожоговой травмой 2–3 степени, находившиеся на лечении в Ожоговом центре Университетской клиники ФГБОУ ВО ПИМУ Минздрава России. Площадь поражения кожи у обследованных пациентов составляла от 10 до 80 % (ср. – 42,8 ± 8,9 %). В зависимости от площади поражения пациенты были разделены на две группы: 1 группа – пациенты с ожогом площадью от 10 до 20 % п.т., 2 группа – пациенты с ожогом более 20 % п.т. Среди пострадавших преобладали люди работоспособного возраста от 21 до 61 года (40,68 ± 6,8), 23 мужчины, 8 женщин. Все пациенты получали комплексное лечение, включавшее инфузионно-трансфузионную, антибактериальную терапию, хирургическое лечение. Протокол исследования был одобрен локальным этическим комитетом ФГОБУ ВО ПИМУ Минздрава России, и каждый пациент дал добровольное информирование согласие на участие в нем.

Кровь для исследования забирали из кубитальной вены: для получения сыворотки – без консерванта, для получения тромбоцитной массы (ТМ) – с цитратом. Сыворотку получали стандартным методом после 15-минутной инкубации при комнатной температуре с последующим центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 минут, отбирали, аликвотировали и замораживали при – 80 °С для последующего исследования.

Для исследования содержания биологически активных протеинов в динамике образцы крови у пострадавших с ожоговой травмой > 20 % п.т. забирали трижды. Первый раз – непосредственно при поступлении в клинику (первые семь дней после травмы), второй – в период разгара заболевания (так называемый «период напряженных компенсаторных процессов» [14] – 10–20 день после инциндента), третий – на этапе полного восстановления кожного покрова перед выпиской из стационара (21 день и более после травмы). Время забора крови для исследования было отделено от времени гемо- и плазмотрансфузий, как минимум на 48 часов. ТМ пациентам не переливалась.

ТМ получали методом двухэтапного центрифугирования и нормировали по концентрации тромбоцитов (1,75×109 тромбоцитов/мл). Для получения ТЛ использовали метод температурного лизиса (три цикла быстрого замораживания при –80 °С на 24 часа с последующим размораживанием при +37 °С) [15]. Такой метод приводит к разрушению α-гранул тромбоцитов и высвобождению из них факторов роста. В этом случае в ТЛ отсутствуют примеси биохимических активаторов, а концентрация факторов FGFb, PDGF- ВВ, TGF-β и VEGF-А достаточно высока. По данным литературы содержание белка в ТЛ при таком способе получения минимально [6], поэтому загрязненность его веществами, способными вызвать неблагоприятные иммунологические реакции, сводится к минимуму.

Далее образцы центрифугировали при 4000 об/мин для осаждения фрагментов клеток, фильтровали через фильтр 0,22 мм и после микроскопического контроля с негативным результатом аликвотировали и замораживали при –80 °С.

Факторы роста (PDGF-BB, VEGF-A, TGF-β, FGFb) в сыворотке и ТЛ определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа, используя наборы реагентов «eBioscience», USA (PDGF – BB, VEGF-A, TGF-β1) и набор фирмы R&D systems (USA) для определения FGFb. Величину оптической плотности регистрировали на анализаторе «Sunrise» (Австрия) с использованием программы «Magellan», позволяющей в автоматическом режиме строить калибровочную кривую и определять концентрацию исследуемых веществ.

Статистическую обработку проводили методами непараметрической статистики с применением критериев парных сравнений Вилкоксона, Манна – Уитни с использованием программ STATISTICA 6.0.

Результаты исследования и их обсуждение

Показано, что как у условно здоровых доноров, так и у пациентов с ожоговой травмой на всех этапах исследования, содержание факторов роста в ТЛ и сыворотке было подвержено значительным колебаниям. При сравнении содержания факторов роста в сыворотке и ТЛ у здоровых доноров и пациентов с ожоговой болезнью, независимо от тяжести ожоговой травмы и срока обследования, отмечается, что уровень исследованных протеинов в сыворотке, как правило, меньше, чем в ТЛ. Полученные данные согласуются с результатами исследований других авторов, демонстрирующих преобладание содержания факторов роста в тромбоцитах по сравнению с сывороткой [11]. При этом надо отметить, что статистически значимых отличий между уровнем протеинов в ТЛ у здоровых и пациентов с ожоговой травмой, независимо от площади поражения и стадии ожоговой болезни, не зафиксировано. В то же время отмечается тенденция к снижению уровня протеинов в сыворотке пациентов при поступлении в стационар, а содержание VEGF-A (табл. 1) у пациентов с ожогом > 20 % п.т., по сравнению с уровнем у здоровых, снижено статистически значимо.

В этой статье поговорим о функции дермальных фибробластов в коже, процессе их старения, а также о методе обновления и стимуляции регенерации кожи путём введения аутологичных фибробластов.

Введение

Роль дермальных фибробластов (ДФ) в обновлении кожи трудно переоценить, поскольку они являются основным клеточным компонентом соединительнотканной основы кожи, обеспечивающим её гомеостаз и морфофункциональную организацию. Очевидна актуальность этой темы для регенеративной (репаративной) косметологии, задача которой — омоложение кожи путём активации естественных процессов её восстановления.

Функции дермальных фибробластов

Из всех функций ДФ наибольшее внимание специалистов в области эстетической медицины и дерматологии сосредоточено на продуцировании этими клетками компонентов внеклеточного матрикса (ВКМ) дермы: коллагена, эластина, протеогликанов, особенно гиалуроновой кислоты (ГК), и структурных гликопротеинов.

Повышенный интерес именно к этой функции ДФ понятен: названные компоненты ВКМ формируют и поддерживают структуру кожи, обеспечивая её упругость и прочность. Причём ДФ не только синтезируют эти вещества, но и обеспечивают их катаболизм путём прямого фагоцитоза «отработанных» фрагментов фибрилл коллагена и эластина, секреции коллагеназы, гиалуронидазы и прочих ферментов.

Резидентные клетки ткани — образующиеся и постоянно пребывающие в этой ткани.

Другая, и не менее значимая для кожи, активность ДФ оставалась до недавнего времени несколько на обочине поля зрения врачей-практиков, однако сегодня она тоже становится объектом пристального внимания клиницистов. Речь идёт о целом ряде важнейших функций фибробластов. Так, продуцируя коллаген IV типа и ламинин, они влияют на формирование базальной мембраны. Фибробласты формируют строму, которая не только служит каркасом (опорой) для эпителия, но и регулирует структурную организацию и функционирование эпителиальных клеток. Они вырабатывают и выделяют факторы клеточного роста (KGF-1 — фактор роста кератиноцитов, GM–CSF — гранулоцитарно-макрафагальный колониестимулирующий фактор роста), иммунорегуляторные интерлейкины IL-6, IL-8. За счёт секреции факторов роста и интерлейкинов и непосредственного взаимодействия с эпителиальными клетками ДФ играют ключевую роль в регуляции эпидермального морфогенеза. Их паракринная активность служит основой для поддержания гомеостаза стволовых кератиноцитов.

Дермальные фибробласты секретируют факторы, влияющие на дифференцировку лимфоцитов, и факторы, регулирующие численность, миграцию и функции гранулоцитов и макрофагов, обеспечивая тем самым поддержание иммунитета кожи. Вырабатывая множество проангиогенных факторов, которые индуцируют дифференцировку и миграцию эндотелиальных клеток, ДФ способствуют образованию и стабилизации сосудов.

Они принимают участие в процессах нейроэндокринной регуляции кожи. Синтезируют биологически активные пептиды: гормоны, биогенные амины, нейропептиды и нейротрансмиттеры, идентичные таковым в центральной нервной и эндокринной системах, экспрессируют рецепторы андрогенов и эстрогенов, посредством которых осуществляется влияние этих гормонов на кожу человека.

Фибробласты, взаимодействуя с различными резидентными клетками: эпидермальными, эндотелиальными, нервными, жировыми, гемопоэтическими, участвуют практически во всех кожных процессах, в том числе — физиопатологических. Таким образом, ДФ представляют собой центральное звено в биологии кожи: они поддерживают не только гомеостаз ВКМ дермы, обеспечивая её ремоделирование и обновление, но и физиологическое состояние других слоёв и структур кожи.


Рис. 1. Взаиморасположение фибробластов и коллагеновых волокон: a — в коже молодых людей (18–29 лет); b — в коже людей старшего возраста (старше 80 лет) (Varani J., et al. 2006, с изм.)

Инволюция дермальных фибробластов

По мере старения организма растёт число ДФ, в которых происходят возрастзависимые изменения, связанные преимущественно с непрерывным накоплением повреждений. Такие ДФ обозначают как «стареющие», или сенесцентные фибробласты (ДФст). Снижается их способность к ремоделированию и организации ВКМ, так как уменьшается синтез и секреция ими основных компонентов ВКМ. Нарушается эпидермальный гомеостаз из‑за негативных изменений в паракринных механизмах, связывающих эпидермис и папиллярный слой дермы. В популяции ДФст происходит увеличение секреции богатого цистеином ангиогенного индуктора — белка 61 (CYR61, или CCN1), стимулирующего продукцию провоспалительных цитокинов и матриксных металлопротеиназ (MMPs). CCN1 и MMPs поддерживают старение клетки путём негативной регуляции гомеостаза коллагена и увеличения его деградации.

Постепенно баланс между синтезом и деградацией коллагена нарушается в пользу последней. Повреждённый коллагеновый каркас ВКМ уже не может удерживать фибробласты в растянутом состоянии, свойственном молодым клеткам. Происходит своего рода коллапс фибробластов, что приводит к нарушению их функций. В процессе инволюции уменьшается численность фибробластов. Снижается и биосинтетическая активность этих клеток, нарушается баланс между синтезом и деградацией ВКМ дермы. В среднем, у пожилых / старых людей, по сравнению с молодыми, общее количество ДФ меньше на 35 %, продукция коллагена в коже снижена на 75 %, причём содержание коллагена уменьшается приблизительно на 1 % в год.

Все сенесцентные изменения в популяции ДФ приводят к постепенному и значительному снижению способности кожи к регенерации и обновлению. Как при этом меняется статус кожи? Уменьшается её толщина, снижается упругость и эластичность, появляются морщины, заломы, птоз тканей — кожа стареет.

Очевидно, что именно ДФ должны быть основной «мишенью» омолаживающих кожу косметологических методов. Так оно и есть: все современные терапевтические воздействия в целях коррекции возрастных изменений кожи — инъекционные, включая PRP-терапию, аппаратные (лазерные, радиочастотные, ультразвуковые) — направлены прежде всего на стимуляцию функциональной активности ДФ, как пролиферативной, так и биосинтетической. Особое место в этом ряду занимает применение аутологичных (собственных) дермальных фибробластов, или SPRS-терапия.

SPRS-терапия как метод оздоровления и обновления кожи

SPRS-терапия (SPRS — от англ. Service for Personal Regeneration of Skin — персонифицированный комплекс лечебно-диагностических процедур для восстановления кожи) — метод регенеративной медицины (РУ ФС №2009 / 308 от 21.07.2010). Его применение позволяет восполнить уменьшившуюся с возрастом популяцию ДФ за счёт введенных в кожу специализированных молодых и функционально активных клеток. Трансплантируются собственные фибробласты кожи пациента, поэтому они полноценно приживаются, интегрируют с резидентной клеточной популяцией и живут «по законам» дермы.

После трансплантации их биосинтетическая активность сохраняется не менее года, причём без какой‑либо дополнительной стимуляции. Как результат, увеличивается синтез коллагена и других компонентов ВКМ, благодаря чему происходит ремоделирование микроструктуры дермы, увеличение её толщины, уменьшение количества и глубины морщин.

Сенесценция — это состояние, при котором клетки с накопленными повреждениями ДНК и истощением механизмов её восстановления перестают делиться, теряют способность к ремоделированию и организации ВКМ.


Рис. 2. Кожа после применения аутоДФ: a — через 1 месяц, b — через 3 месяца, c — через 6 месяцев, d — через 12 месяцев. Стрелками указаны группы введённых культивированных аутоДФ. Левая колонка — окраска гематоксилином и эозином, правая колонка — импрегнация нитратом серебра. Ув. ×200. Препараты и микрофотографии Р. В. Деева.

Описание технологии

В специализированной лаборатории Института стволовых клеток человека, соответствующей международным стандартам GMP*, из 4 мм биоптата кожи пациента получают клеточный препарат, содержащий культивированные аутологичные ДФ (аутоДФ). На этапах клеточного процессинга происходит отбор и стимуляция только функционально активных ДФ, которые, несмотря на старение организма, сохраняют высокую способность к делению и синтезу важных для кожи компонентов. Дело в том, что пролиферативный потенциал всей популяции дермальных фибробластов взрослого человека в течение всей его жизни остаётся на довольно высоком уровне — благодаря наличию в фибробластическом диффероне стволовых / прогениторных клеток. Это клетки-предшественницы, которые отвечают за обновление клеточной популяции дермы. Как показали исследования in vitro, первичные культуры, полученные даже от очень пожилых людей (95 лет), содержат до 14 % митотически активных фибробластов.


Рис. 3. Относительное изменение толщины кожи после применения аутоДФ (по результатам гистологических исследований).

Данный факт подтверждается и нашими экспериментами: культуры фибробластов дермы, полученные от пациентов 18–82 лет, характеризуются довольно высокой эффективностью колониеобразования (45.0±9.5 %), независимо от возраста донора. Это даёт возможность из небольшого биоптата кожи любого взрослого человека получить необходимое для проведения терапии количество функционально активных клеток.

После трансплантации культивированных ауто ДФ в дерму их биосинтетическая активность сохраняется. В своей работе мы вводили полученный клеточный материал одновременно и в кожу лица, и в кожу за ушной раковиной, откуда затем проводили забор биоптата для гистологического изучения. Наши исследования показали:

  • трансплантированные аутоДФ синтезировали компоненты ВКМ дермы на протяжении как минимум 12 месяцев [Рис. 2];
  • трансплантированные аутоДФ присутствовали в дерме небольшими группами, без признаков митотической активности, то есть без признаков деления клеток (следовательно, риск развития каких‑либо гиперпластических процессов при их использовании отсутствует);
  • образовались новые коллагеновые волокна;
  • толщина дермы увеличилась в среднем на 62,5±13,6 % (р=0,028) в течение первых 12 месяцев после применения аутоДФ [Рис. 3].

Через 24 месяца после применения аутоДФ в дерме также регистрировали отдельные группы фибробластоподобных клеток [Рис. 4], продуцирующих коллагеновые волокна. Однако признаков созревания (утолщения) коллагена не наблюдали, из чего следует, что через два года после трансплантации аутоДФ интенсивность их синтетической активности (по сравнению с таковой в течение первого года после трансплантации) была снижена.


Рис. 4. Кожа пациента М. (54 г.) после применения аутоДФ через 24 месяца. Левая колонка — окраска гематоксилином и эозином, правая колонка — импрегнация нитратом серебра. Ув. ×200. Препараты и микрофотографии Р. В. Деева.

Скорее всего, это связано с уровнем физиологических потребностей дермы (известно, что для обеспечения её физиологического состояния достаточно незначительной функциональной активности фибробластов). По всей видимости, трансплантированные аутоДФ полноценно интегрировались с дермой, стали естественной составляющей её основной клеточной популяции — фибробластического дифферона — и находятся под контролем микроокружения.

Выводы гистологического исследования:

  • введенные аутоДФ сохраняют свою жизнеспособность в дерме;
  • они располагаются в дерме преимущественно группами;
  • их функционирование не приводит к неблагоприятным последствиям, клетки пролиферативно не активны;
  • на всех сроках наблюдения в дерме регистрируются признаки увеличения её объёма и процесс синтеза молодых коллагеновых волокон.

Выявленная на гистологическом уровне положительная динамика изменений кожи после применения аутоДФ полностью соответствует клинической картине. Уже через 10–14 дней после окончания курса SPRS-терапии отмечается повышение упругости кожи, уменьшение её рельефности (уменьшение выраженности морщин), улучшение цвета и контуров лица. Эффект имеет нарастающий характер. Так, если через месяц после инъекции на «хорошо» и «отлично» клинический результат оценили 88 % пациентов, то уже через три месяца и позже — 100 %. Врачи-исследователи через месяц определили результат как «хороший» и «отличный» у 86 % пациентов, через три месяца и позже — у 100 % пациентов. Положительные, прогрессирующие со временем (на протяжении как минимум 12 месяцев) изменения состояния кожи подтверждены нами и с помощью инструментальных методов исследования.

Заключение

Инновационная технология — SPRS-терапия, основанная на принципах регенеративной медицины, — позволяет восстанавливать утраченные с возрастом структуру и функции дермы за счёт уникального биологического механизма собственных коллагенобразующих клеток кожи пациента.

SPRS-терапия используется в отечественной эстетической медицине более восьми лет, зафиксировано более 1000 клинических наблюдений пациентов, из которых более 80 % повторно (два и более раз), пролечив одну область кожи, обращались в клиники для лечения этим методом кожи других областей.

Для врачебной практики важно, что SPRS-терапия является не только самостоятельным эффективным методом ремоделирования дермы, но и хорошей базовой основой для применения других косметологических вмешательств, направленных на стимуляцию синтетической активности фибробластов, что позволяет в течение длительного времени поддерживать кожу пациента в хорошем состоянии.

Авторы:
Алла Зорина, к. м. н., врач-биохимик, Москва.
Вадим Зорин, к. б. н., врач-биофизик, Москва.

Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования

Отдел радиационной медицины, гематологии, онкологии и токсикологии, ожоговое отделение ФГБУ «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им. А.М. Никифорова» МЧС России, Санкт-Петербург, Россия

Клиника пластической хирургии и косметологии «VIP Clinic», Калининград, Россия

Кафедра хирургии им. Н.Д. Монастырского Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования Росздрава

Изучение иммуногистохимических показателей в эпидермисе и дерме при применении средств для регенерации кожи

Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования

При использовании деструктивных методов в косметологии важным аспектом является продолжительность реабилитационного периода. Поиск новых средств, ускоряющих процессы регенерации кожи, имеет большое практическое значение. Цель исследования — изучение иммуногистохимических показателей кожи в ответ на применение препарата с эпидермальным фактором роста и покрытия, включающего гиалуроновую кислоту и коллаген. Материал и методы. У восьми пациентов с ожоговой травмой изучали биоптаты краевой зоны донорского участка кожи на 7-й день терапии. Из них двое получали лечение спреем с эпидермальным фактором роста (ЭФР), двоим накладывали покрытие с гиалуроновой кислотой и коллагеном (ПГКК), двое получали лечение ЭФР и ПГКК и двоих лечили дермазином (контрольная группа). Из полученных биоптатов в криостатных срезах иммуногистохимическим методом исследовали экспрессию маркеров Ki67, Bcl-2 к рецептору EGFR и HLA-DR. Результаты. Применение ЭФР (низкие значения Ki67, высокие — Bcl-2 и HLA-DR) позволяет сместить баланс от пролиферации к дифференцировке для восстановления эпидермиса. Применение дермазина (высокие значения Ki67, отсутствие Bcl-2 и высокие значения HLA-DR в дерме) может свидетельствовать о затягивании фазы пролиферации. Применение только ПГКК не препятствует воспалительному процессу в коже. Сочетание ЭФР и ПГКК сохраняет пролиферацию и дифференцировку клеток в эпидермисе и дерме, имеет высокие значения HLA-DR и не выявляет маркер к EGFR в дерме. Таким образом, выявлены особенности регенерации донорских участков кожи под воздействием разных методов терапии.

Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования

Отдел радиационной медицины, гематологии, онкологии и токсикологии, ожоговое отделение ФГБУ «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им. А.М. Никифорова» МЧС России, Санкт-Петербург, Россия

Клиника пластической хирургии и косметологии «VIP Clinic», Калининград, Россия

Кафедра хирургии им. Н.Д. Монастырского Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования Росздрава

Использование деструктивных методов в косметологии довольно распространено. Важным аспектом является продолжительность реабилитации пациента после выполненной процедуры. В связи с этим изучение средств, способных ускорить процесс регенерации поврежденного участка кожи, представляет собой актуальное научно-практическое направление в косметологии.

В основе заживления неглубоких ран лежит инициация воспалительной реакции, опосредованная факторами роста, цитокинами и хемокинами, эпителизация за счет сохранившихся придатков кожи и краевого эпидермиса, что в итоге приводит к полному и быстрому восстановлению кожи с незаметными рубцами или без них [1, 2].

Известно, что при использовании различных цитокинов, факторов роста, покрытий для ран процессы регенерации протекают быстрее. Наше внимание привлекли препарат на основе эпидермального фактора роста (ЭФР) и покрытие, состоящее из гиалуроновой кислоты и коллагена (ПГКК).

ЭФР относится к цитокинам и полипептидам, состоит из 53 аминокислот, присутствует во всех клетках тканей организма и регулирует их рост. ЭФР управляет ростом клеток эпителия, эндотелия и фибробластов, улучшает пролиферацию тканей, регулирует хемотаксис. В нормальных условиях содержание факторов роста в организме человека относительно невелико и стабильно. Однако при повреждениях в полости раны возрастает количество рецепторов, чувствительных к ЭФР, что приводит к повышению его концентрации и миграции клеток из неповрежденных тканей в пораженные участки. Поврежденная поверхность в короткие сроки выстилается клетками, что способствует заживлению кожи и слизистых оболочек без образования рубцов, препятствует развитию раневых инфекций и значительно сокращает сроки заживления [3].

На заживление ран положительно влияют различные раневые покрытия. Оптимальные повязки или покрытия должны обеспечить защиту раны от дальнейшей травмы, гарантировать влажную внутреннюю поверхность покрытия, абсорбировать или удалять избыток экссудата, предотвращать загрязнение и обеспечивать среду, способствующую реализации естественных защитных механизмов [4].

Цель исследования: изучить иммуногистохимические показатели кожи в ответ на применение препарата с ЭФР и покрытия, включающего гиалуроновую кислоту и коллаген.

Материал и методы

Обследована группа из 8 пациентов, получавших лечение в Ленинградской областной клинической больнице по поводу ограниченных глубоких ожогов. Пациентам была показана аутотрансплантация кожи (с участков здоровой кожи с бедер и ягодиц). После взятия материала регенерация донорских участков происходила с помощью различных препаратов. Пациентов распределили в четыре группы: 2 пациента на донорские участки кожи получали наружно препарат на основе ЭФР (GeneTime, ООО «НовоНексус», Китай), 2 пациента — покрытие ПГКК (материал гистоэквивалент-биопластический G-Derm/ДЖИ-ДЕРМ, ООО «Джи-Групп», Россия), 2 пациента — сочетание ЭФР с ПГКК, 2 пациента (контроль) — крем дермазин («LEK», Словения). Через 7 дней выполняли взятие материала из регенерированной зоны.

Иммуногистохимические исследования образцов кожи проводили на криостатных срезах по ранее описанной методике [5]. Криостатные срезы толщиной 5 мкм фиксировали абсолютным ацетоном, высушивали и окрашивали антителами с целью выявления экспрессии маркеров пролиферации (Ki67), антиапоптоза (Bcl-2), рецептора к эпидермальному фактору роста (EGFR) и антигену гистосовместимости (HLA-DR). В работе использовали следующие антитела: Anti-Ki-67 («Bio Genex», США), Anti-Bcl-2 («Dako», Дания), Anti-EGFR («Bio Genex», США), Anti-HLA-DR («Diagnostic Bio Systems», США). Иммуногистохимическое исследование проводили с использованием набора полимера Super Sensitiv TM Polimer HRP IHC Detection Systems («Bio Genex»). Результат реакции проявляли хромогеном диаминобензидином (DAB), препараты окрашивали гематоксилином. Готовые гистологические препараты фотографировали. По отдельности проводили съемку эпидермиса и дермы.

Фотографии обрабатывали с применением программы Морфология 5.0, где выделяли области скопления белка — иммуногистохимического маркера, в зависимости от характера маркера выполняли морфометрию. Для Ki67 подсчитывали количество меченых клеток в поле зрения микроскопа, для Bcl-2 и EGFR — оптическую плотность, HLA-DR — доля окрашенной площади в препарате (в %).

cтатистическую обработку результатов проводили в программе Statistica 6.1. Соответствие показателей иммуногистохимического исследования нормальному распределению оценивали с помощью критерия Колмогорова—Смирнова. Для выявления различий между группами был проведен однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA). Внутригрупповые различия выявляли с использованием апостериорных критериев, в частности критерия Тьюки (Tukey HSD). Достоверность различий принимали на уровне р≤0,05.

Результаты

Однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) сравнения четырех групп показал, что применение местных лечебных средств влияет на все исследованные маркеры эпидермального слоя кожи: Ki67 (F=25,1; р≤0,001), HLA-DR (F=76,9; р≤0,001), Bcl-2 (F=17,5; р≤0,001), EGFR (F=5,4; р≤0,01). (табл. 1).


Таблица 1. Изменчивость маркеров эпидермиса под влиянием местных лечебных средств. Показатели однофакторного дисперсионного анализа Примечание. Здесь и в табл. 2: SS — сумма квадратов отклонения от среднего, df — степени свободы, MS — средний квадрат, F — критерий Фишера, p — уровень значимости.

Анализ дермального слоя в группах показал, что проведенные процедуры влияют на маркеры Ki67 (F=9,2; р≤0,001), EGFR (F=110,4; р≥0,001), HLA-DR (F=70,3; р≤0,001), но не отражаются на Bcl-2 (F=0,48; р>0,05) (табл. 2).


Таблица 2. Изменчивость маркеров дермы под влиянием местных лечебных средств. Показатели однофакторного дисперсионного анализа

Результаты сравнивали между указанными группами. Через 7 дней раневого заживления во всех вариантах можно наблюдать процессы активной пролиферации в коже. Меньше всего пролиферирующих клеток (маркер Ki67) в эпидермисе отмечено при использовании ЭФР+ПГКК (табл. 3, рис.

Таблица 3. Показатели маркера Ki67 в коже, количество меченых ядер (Mean + SEM) Примечание. * — р≤0,05; ** — р≤0,01; *** — р≤0,001, различие достоверно по сравнению с группой, пролеченной ПГКК; ^ — р≤0,05; ^^^ — р≤0,001, различие достоверно по сравнению с группой, пролеченной дермазином. 1). Рис. 1. Показатели маркера Ki67 в эпидермисе донорской раны (ув. 250) на 7-й день после терапии: спреем с ЭФР (а); покрытием с ГКК (б); сочетанием спрея с ЭФР и ПГКК (в); дермазином (г). Больше всего пролиферирующих клеток было при использования ПГКК и дермазина (различия достоверны). Показатели пролиферации при использовании отдельно ЭФР занимают среднюю позицию и достоверно не отличаются от других групп.

В дерме также сохраняется выявленная разница, но с более выраженными различиями между группами, в группах с использованием ЭФР (ПГКК +ЭФР или только ЭФР) пролиферация достоверно ниже, чем в группе дермазина и ПГКК.

По маркеру Bcl-2 межгрупповые сравнения вы-явили достоверные отличия в эпидермисе в группах применения ЭФР (табл. 4, рис.

Таблица 4. Показатели маркера Bcl-2 в коже, оптическая плотность (Mean + SEM) Примечание. Здесь и в табл. 5, 6. * — р≤0,05; ** — р≤0,01; *** — р≤0,001, различие достоверно по сравнению с группой, пролеченной препаратом ЭФР; ^ — р≤0,05; ^^ — р≤0,01; ^^^ — р≤0,001, различие достоверно по сравнению с группой, пролеченной дермазином. 2). Рис. 2. Показатели маркера Bcl-2 в эпидермисе донорской раны (ув. 250) на 7-й день после терапии: спреем с ЭФР (а); покрытием с ГКК (б); сочетанием спрея с ЭФР и ПГКК (в); дермазином (г). Значение показателя содержания антиапоптотического маркера Bcl-2 при применении только ЭФР достоверно выше, чем при использовании ЭФР+ПГКК или только ПГКК. При использовании дермазина маркер в эпидермисе на этом сроке не выявлен.

В дерме статистически значимых различий по этому маркеру между группами не наблюдается.

По маркеру HLA-DR достоверные отличия выявлены в группах применения ЭФР (табл. 5, рис.

Таблица 5. Показатели маркера HLA-DR в коже, доля площади в % (Mean + SEM) 3). Рис. 3. Показатели маркера HLA-DR в коже донорской раны (ув. 250) на 7-й день после терапии: спреем с ЭФР (а); покрытием с ГКК (б); сочетанием спрея с ЭФР и ПГКК (в); дермазином (г). Значение показателя в эпидермисе при использовании только ЭФР достоверно выше, чем при использовании ЭФР+ПГКК или только ПГКК. В группе использования дермазина маркер HLA-DR не выявлен.

В дерме, напротив, при ЭФР содержание маркера наименьшее, а при применении дермазина показатели HLA-DR наибольшие и эти различия статистически значимы. Разницы между группами ПГКК и ПГКК+ЭФР по HLA-DR не выявлено.

По маркеру EGFR в эпидермисе наибольшие значения выявлены в группе применения ЭФР (табл. 6, рис.

Таблица 6. Показатели маркера EGFR в коже, оптическая плотность (Mean + SEM) 4) Рис. 4. Показатели маркера EGFR в эпидермисе донорской раны (ув. 500) на 7-й день после терапии: спреем с ЭФР (а); покрытием с ГКК (б); сочетанием спрея с ЭФР и ПГКК (в); дермазином (г). и эти показатели достоверно выше, чем при использовании ЭФР+ПГКК или только ПГКК, но не отличаются от показателей в группе дермазина.

В дерме не обнаружено разницы в содержании маркера между вариантами ЭФР и ПГКК и дермазина, однако выявлено полное отсутствие экспрессии рецептора на этом сроке в группе совместного использования ЭФР+ПГКК.

По данным литературы, антиапоптозный белок Bcl-2 экспрессируется преимущественно в зонах, содержащих пролиферирующие клетки или клетки с большой продолжительностью жизни, он оказывает гомеостатическое влияние на численность клеточной популяции [6]. Экспрессия Bcl-2, повышая устойчивость клеток к гибели по механизму апоптоза, защищает эндотелий, мигрирующие стволовые клетки и фибробласты от высокоактивных продуктов цитотоксических клеток и макрофагов в месте воспаления [7, 8].

Факторы роста семейства EGF, продуцируемые в коже макрофагами и кератиноцитами, осуществляют важные функции в эпителизации раневой поверхности. Эти аутокринные лиганды прикрепляются к EGFR на кератиноцитах и инициируют механизм последующего каскада, поддерживая пролиферацию, миграцию кератиноцитов и реэпителизацию [9]. Уменьшение экспрессии EGFR на поверхности клеток и подавление передачи сигналов EGFR может быть ключевым фактором в патогенезе хронических ран [1].

Иммуногистохимический анализ показал, что существуют некоторые закономерности, выявленные при окраске на маркеры HLA-DR, Bcl-2 и Ki67 в эпидермисе и дерме, которые не противоречат физио-логическому течению процессов регенерации в коже. Наименьшие показатели пролиферативной активности эпидермиса в группах с применением ЭФР, которые сопровождаются увеличением содержания Bcl-2, могут свидетельствовать о постепенном смещении баланса от пролиферации к дифференцировке эпидермиса, о восстановлении эпителиального слоя. В пользу процессов восстановления при применении ЭФР свидетельствует также рост HLA-DR-маркеров в эпидермисе. Данные показатели близки по своим значениям к показателям нормальной интактной кожи, установленным нами ранее [5].

Напротив, наибольшие показатели пролиферации клеток эпидермиса при применении дермазина, при невозможности выявить маркер Bcl-2, может свидетельствовать о затягивании фазы пролиферации. Самые высокие показатели HLA-DR в дерме при использовании дермазина также свидетельствуют об активном воспалительном процессе в наблюдаемые сроки.

Мы высказали предположение о наличии некоторого влияния методов лечения на иммуногистохимические показатели регенерирующей донорской раны.

Покрытие ПГКК сохраняет влажную среду в ране, необходимую для естественного заживления. При использовании только ПГКК в эпидермисе и в дерме количество пролиферирующих клеток (Ki67) наиболее высокое по сравнению с другими группами, однако их показатель дифференцировки (Bcl-2) низкий. Через 1 нед после использования ПГКК в дерме иммунокомпетентных клеток (HLA-DR) в 3 раза больше, чем в эпидермисе, а экспрессия маркера EGFR ниже в эпидермисе по сравнению с дермой. Можно предположить, что ПГКК не препятствует развитию воспалительного процесса в коже при лечении.

Использование ЭФР на донорских участках кожи позволяет сохранить пролиферативную активность клеток и повысить их устойчивость к апоптозу, способствует миграции иммунокомпетентных клеток в эпидермис.

Лечение ПГКК+ЭФР сохраняет пролиферативную активность клеток, в дерме поддерживает воспалительный процесс и в большей степени сохраняет устойчивость клеток к апоптозу, чем при использовании только ПГКК, влияет на регенераторную активность в эпидермисе.

Малое количество пациентов не позволяет нам делать окончательные выводы, но настраивает на дальнейшую работу в изучении вопросов, связанных с регенерацией кожи.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Т.Н. Королькова

Сбор и обработка материала — Е.В. Круглик, Е.В. Зиновьев, Н.В. Калмыкова

Статистическая обработка данных — Е.В. Круглик, Н.В. Калмыкова

Написание текста — Е.В. Круглик, Т.Н. Королькова

Редактирование — Т.Н. Королькова

Authors’ contributions:

The concept and design of the study — T.N. Korolkova

Collecting and interpreting the data — E.V. Kruglik, E.V. Zinovyev, N.V. Kalmykova

Statistical analysis — E.V. Kruglik, N.V. Kalmykova

Drafting the manuscript — E.V. Kruglik, T.N. Korolkova

Revising the manuscript — T.N. Korolkova

Сведения об авторах

КАК ЦИТИРОВАТЬ:

Оренбургская государственная медицинская академия

Оренбургская государственная медицинская академия

Оренбургская государственная медицинская академия

Оренбургская государственная медицинская академия

Оренбургская государственная медицинская академия

Оренбургская государственная медицинская академия

Оренбургская государственная медицинская академия

Использование факторов роста фибробластов для лечения ран и ожогов

Журнал: Хирургия. Журнал им. Н.И. Пирогова. 2012;(12): 72‑76

Никитенко В.И., Павловичев С.А., Полякова В.С., Копылов В.А., Гнедой С.Н., Миханов В.А., Никитенко И.Е. Использование факторов роста фибробластов для лечения ран и ожогов. Хирургия. Журнал им. Н.И. Пирогова. 2012;(12):72‑76.
Nikitenko VI, Pavlovichev SA, Poliakova VS, Kopylov VA, Gnedoĭ SN, Mikhanov VA, Nikitenko IE. The use of fybropblast growth factor in wound and burn treatment. Pirogov Russian Journal of Surgery = Khirurgiya. Zurnal im. N.I. Pirogova. 2012;(12):72‑76. (In Russ.).

Оренбургская государственная медицинская академия

Оренбургская государственная медицинская академия

Оренбургская государственная медицинская академия

Оренбургская государственная медицинская академия

Оренбургская государственная медицинская академия

Оренбургская государственная медицинская академия

Оренбургская государственная медицинская академия

Оренбургская государственная медицинская академия

Заживление ран - динамический процесс, который включает в себя механизмы свертывания крови, воспаления, клеточной пролиферации, формирования новых кровеносных сосудов, реконструкции экстрацеллюлярного матрикса [73] и контролируется множеством клеточных факторов [1]. Биологически заживление ран протекает через три общие стадии: воспалительную, пролиферативную и репаративную, или ремоделирование [2]. Раневой процесс является комплексным и определяется взаимодействием факторов роста и клеточных ассоциаций фибробластов, эпителиальных и эндотелиальных клеток, играющих ключевую роль [7]. В настоящее время можно считать установленным, что заживление ран ускоряется различными факторами роста, влияющими на пролиферацию и дифференцировку клеток [4, 56].

Известно, что факторы роста фибробластов - семейство полипептидов, участвующих в процессах ангиогенеза, заживления ран и в эмбриональном развитии. У млекопитающих и человека до недавнего времени было установлено 22 пептида, относящихся к семейству факторов роста фибробластов, с молекулярной массой, колеблющейся от 17 до 34 кДа [48]. Недавно был идентифицирован новый член семейства факторов роста фибробластов - фактор роста фибробластов - 23. Он активно регулирует количество фосфатов крови через механизмы обратной связи, вовлекающие гормоны паращитовидных желез и витамин D [53]. Факторы роста фибробластов у человека продуцируются кератиноцитами, фибробластами, хондроцитами, эндотелиальными, гладкомышечными и тучными клетками [15].

В период эмбрионального развития они играют важную роль в регуляции клеточной пролиферации, миграции и клеточной дифференцировке. В зависимости от типа клетки, стадии ее развития, вида фактора роста фибробластов она может ответить пролиферацией, миграцией, апоптозом или стимуляцией/ингибицией дифференцировки [20].

Во взрослом организме факторы роста фибробластов. поддерживая гомеостаз, участвуют в восстановлении тканей (физиологическая регенерация) или синтезируются в ответ на повреждение (репаративная регенерация). Они стимулируют рост множества типов клеток, включая фибробласты, эндотелиальные клетки, гладкомышечные клетки сосудов и миобласты [14]. Некоторые факторы роста фибробластов являются необходимыми при передаче нервного импульса в центральной и периферической нервной системе [48]. Факторы роста фибробластов обладают цитопротективным свойством, приводя к быстрому ограничению цитолиза [9].

Факторы роста фибробластов опосредуют свои биологические эффекты через связывание с четырьмя специфическими, высокоаффинными рецепторами, расположенными на клеточной мембране. Они принадлежат к семейству тирозин-киназных рецепторов [51], состоят из двух или трех внеклеточных иммуноглобулиноподобных доменов (внеклеточная кислая область) и цитоплазматической тирозинкиназной части [47]. Для активации этих рецепторов необходимо взаимодействие факторов роста фибробластов с такими протеогликанами, как гепарин и гепарансульфат [27, 60, 70].

Наиболее важными в процессе заживления ран кожи являются фактор роста фибробластов-2, фактор роста фибробластов-7 и фактор роста фибробластов-10 [13]. Фактор роста фибробластов-2, или основной фактор роста фибробластов - это полипептид, состоящий из 146 аминокислот, имеющий молекулярную массу 16,5-18,2 кДа и оказывающий митогенное действие на клетки тканей нейроэктодермального и мезодермального происхождения [18]. Он является одним из наиболее важных проангиогенных медиаторов, участвующих в заживлении ран [59].

Основной фактор роста фибробластов стимулирует деление фибробластов, сосудистых эндотелиальных клеток и кератиноцитов in vitro, формирование новых сосудов, грануляционной ткани, эпидермальную регенерацию in vivo и регулирует гомеостатические процессы в нервной системе [36, 38]. При искусственном уменьшении концентрации основного фактора роста фибробластов у экспериментальных животных нарушается процесс трансформации фибробластов в фиброциты, а также меняется соотношение клеток фибробластического ряда [8].

Основной фактор роста фибробластов обнаружен в разнообразных клетках и из всех известных факторов роста имеет наиболее широкий диапазон клеток-мишеней. Он способен значительно повышать пролиферацию клеток в концентрации 1 нг/мл [18].

Фактор роста фибробластов-2 стимулирует секрецию эндотелиальными клетками протеазы и активаторов плазминогена, которые деградируют базальную мембрану сосудов, усиливая миграцию клеток в окружающий матрикс, способствуя тем самым формированию новых сосудов [19]. Также он активирует синтез матриксных макромолекул, особенно дермальных гликозаминогликанов, гиалуроновой кислоты [33] и ингибирует синтез коллагеназы-1 в кератиноцитах [50].

Этот цитокин обнаруживается в экстрацеллюлярном матриксе и на базальной мембране, будучи связанным с гепарансульфат протеогликаном, и действует локально при возникновении повреждения [45]. N. Nissen и соавт. [42] показали, что его уровень быстро возрастает в зоне операционной раны. Фактор роста фибробластов-2 играет важную роль в формировании грануляционной ткани, реэпителизации и ремоделировании тканей [51].

H. Song и соавт. [55] показали, что основной фактор роста фибробластов синтезируется в нормальной коже вокруг сосудов. При повреждении кожных покровов синтез его резко увеличивается эндотелиоцитами и фибробластами.

Экспрессия основного фактора роста фибробластов значительно увеличивается в ожоговой ране. Его синтез повышается через 6 ч после ожога и достигает максимума через сутки после травмы. Его гены чаще всего обнаруживаются в цитоплазме фибробластов [26]. H. Wang и соавт. [63] установили, что эпителиальные клетки начинают усиленно синтезировать основной фактор роста фибробластов через 30 мин после ранения, а максимальная его концентрация обнаруживается уже через 24-96 ч.

G. McGee и соавт. [39] предположили, что основной фактор роста фибробластов может способствовать более быстрому заживлению ран. Они изучили его действие на крысах. На 3-и сутки после получения раны крысам наносили фактор роста фибробластов-2 в дозе 400 нг. При гистологическом исследовании тканей из раневых дефектов на 5, 6 и 7-е сутки обнаружили более быстрое заживление и лучшую их организацию.

B. Cheng и соавт. [17] показали, что основной экзогенный фактор роста фибробластов влияет на процесс заживления раны, воздействуя на механизмы миграции сосудистых эндотелиальных клеток. В группе животных, получавших фактор роста фибробластов-2, уровень пролиферации сосудистого эндотелия был явно выше на 7-е и 14-е сутки по сравнению с контролем. Его применение для лечения поверхностных ожогов площадью 30% у крыс также способствовало повышению уровня эпителизации по сравнению с контролем. M. Komori и соавт. [32] в экспериментальной работе на животных выявили значительное усиление ангиогенеза на ранних этапах заживления ран при локальном нанесении на них фактора роста.

T. Yukami и соавт. [69] показали, что применение основного фактора роста фибробластов уже на 7-е сутки нормализует раневой процесс, усиливает миграцию кератиноцитов, ангиогенез, формирование грануляционной ткани и экспрессию других факторов роста. H. Mutsuzaki и соавт. [40] считают, что применение фактора роста фибробластов-2 снижает уровень воспаления в ранах.

Применение основного фактора роста фибробластов повышает уровень выживаемости кожных трансплантатов из-за повышения их реваскуляризации. Так, T. Sun и соавт. [57] установили, что при его применении кожные лоскуты у крыс некротизировались в 18,2% случаев, что было ниже по сравнению с контролем, который составил 37,14%. P. Liu и соавт. [35] показали, что комбинация фактора роста фибробластов-2 и сосудистого эндотелиального фактора роста значительно повышала выживаемость кожных лоскутов у крыс. Однако B. Bandera и соавт. [12] получили данные, говорящие о том, что основной фактор роста фибробластов значительно лучше предохраняет кожные трансплантаты от некроза, чем сосудистый эндотелиальный фактор роста.

A. Dantas Filho и соавт. [21] обнаружили ускорение заживления мультибактериально загрязненных ран при применении основного фактора роста фибробластов, который к тому же стимулировал созревание коллагена.

Y.-W. Niu и соавт. [43] исследовали действие основного фактора роста фибробластов на ожоги II степени у крыс, страдающих диабетом. На 14-й день после получения ожогов в группе, в которой использовался препарат, уровень заживления был выше, чем у крыс, страдающих диабетом (53,14±11,44% против 25,40±3,00% соответственно).

Применение факторов роста фибробластов для стимуляции заживления ран показало благоприятные результаты и в клинической практике. Так, Х. Fu и соавт. [25] исследовали влияние основного рекомбинантного свиного фактора роста фибробластов на заживление ран различной этиологии. Клинические исследования проведены у 839 пациентов с ожогами, донорскими ранами. 641 пациент с подобными ранами составил контрольную группу. С ожогами II и III степени было 654 пациента: 330 получали рекомбинантный свиной основной фактор роста фибробластов и 324 - плацебо. В группе донорских ран 509 пациентов получали исследуемый препарат и 317 составили группу контроля. Все поверхностные, глубокие ожоги и донорские раны при использовании препарата имели более высокий темп формирования грануляционной ткани и эпидермальной регенерации по сравнению с группами контроля.

Z. Wu и соавт. [64] в ретроспективном анализе лечения 72 больных с глубокими термическими ожогами отметили, что ранние аппликации основного фактора роста фибробластов во многих наблюдениях предотвращают возникновение сепсиса, а также ускоряют заживление ожоговых ран. Y. Yao и соавт. [68] отметили сокращение времени заживления хирургических ран при применении различных доз фактора роста фибробластов-2.

M. Noguchi и соавт. [44] описали 3 наблюдения ишемических язв, леченных спреем основного фактора роста фибробластов. У всех больных он способствовал ускорению заживления ран и полной их эпителизации. Для излечения больных с устойчивыми к терапии ранами, имеющими обширные полости, A. Nakanishi и соавт. [41] применили рекомбинантный человеческий основной фактор роста фибробластов совместно с коллагеновой губкой и получили их быстрое заживление.

C. Yao и соавт. [67] применили ростовой фактор для лечения хронических язв. Они лечили 58 больных, в том числе 30 получали основной фактор роста фибробластов, 28 человек были группой плацебо. В 90% наблюдений в опытной группе язвы зажили через 3 нед после начала лечения, в группе плацебо отмечено заживление только 53,6% язв. Никаких побочных эффектов при применении данного препарата не возникло. K. O’Goshi и H. Tagami [46] описали 9 наблюдений различных хронических кожных язв, стойких к терапии, которые успешно были излечены с помощью распыления на рану фактора роста фибробластов-2. При этом наблюдалось ускорение процессов заживления ран с последующей их эпителизацией.

В ожоговом отделении Beijing Jishuitan Hospital в Китае с марта 2000 г. по июнь 2006 г. находились на лечении 18 пациентов с хроническими кожными язвами. Продолжительность их болезни составляла от полугода до 4 лет. При обычной терапии язвы не заживали. При использовании основного фактора роста фибробластов полное заживление ран в течение 6 нед отмечено в 83,3% наблюдений и средняя длительность заживления оказалась равной 34,4 дня. В течение 1-3 лет у 14 пациентов рецидивов язв не было. С 4 пациентами исследователи потеряли контакт [16].

S. Akita и соавт. [10] продемонстрировали возможность избежать образования гипертрофических рубцов после ожоговых ран при одновременном применении хирургической обработки и основного фактора роста фибробластов с последующим пластическим закрытием ран. Отмечено значительное уменьшение толщины и жесткости послеожогового рубца по сравнению с контролем.

H. Eto и соавт. [23] считают, что фактор роста фибробластов-2 можно использовать для лечения гипертрофических и келоидных рубцов.

Другими важными членами семейства ростовых факторов являются фактор роста фибробластов-7, или фактор роста кератиноцитов-1, и его гомолог фактор роста фибробластов-10, или фактор роста кератиноцитов-2, которые выделяются в «острых» ранах [29]. Фактор роста фибробластов-7 был первоначально идентифицирован как специфичный паракринный фактор роста для эпителиальных клеток [24]. Последующие исследования выявили, что фактор роста кератиноцитов-1 выделяется во время получения травмы кожи у животных и у людей и ускоряет их заживление [49]. Экспрессия фактора роста кератиноцитов-2 также увеличивается при повреждениях кожных покровов.

Факторы роста фибробластов-7 и -10 взаимодействуют с рецепторами факторов роста фибробластов-2-IIIb, которые находят только в кератиноцитах. Взаимодействие с рецепторами происходит с помощью гепарина, но его высокие концентрации ингибируют активность данных цитокинов [31, 61]. Исследования in vitro показали, что факторы роста фибробластов-7 и -10 стимулируют пролиферацию и миграцию кератиноцитов и играют важную роль в реэпителизации [37, 52]. Y. Yang и соавт. [66] показали, что фактор роста кератиноцитов-2 более эффективно стимулирует пролиферацию кератиноцитов по сравнению с эпителиальным фактором роста.

S. Tagashira и соавт. [58] установили, что синтез фактора роста фибробластов-10 повышается через сутки после получения раны и снижается через 3 сут. Авторы предположили, что он является первичным фактором, участвующим в заживлении ран. Считается, что факторы роста кератиноцитов значительно усиливают эпителизацию ран [11, 22, 34].

Y. Xia и соавт. [65] в экспериментальной работе определили, что фактор роста кератиноцитов-1 и -2 значительно усилил реэпителизацию ран ишемизированных тканей у кроликов. Кроме того, фактор роста кератиноцитов-2 способствовал образованию грануляционной ткани, хотя данный эффект отсутствовал при применении фактора роста кератиноцитов-1. Имелась выраженная пролиферация дермальных клеток при применении фактора роста фибробластов-10 на 7-й день по сравнению с таковой без его применения. Авторы считают, что фактор роста кератиноцитов-2 по сравнению с фактором роста кератиноцитов-1 наиболее эффективен и способствует формированию менее выраженных рубцов. P. Jimenez и M. Rampy [30] подтвердили ускорение заживления ран кожи при применении фактора роста кератиноцитов-2, определив его как мощный стимулятор заживления ран, увеличивающий механическую прочность рубца вследствие повышения содержания коллагена.

C. Sobral и соавт. [54] показали, что генетически модифицированные кератиноциты с усиленным синтезом фактора роста кератиноцитов, а также добавление его к культивированным кератиноцитам снижают жизнеспособность бактерий Pseudomonas aeruginosa.

Результаты многочисленных экспериментальных работ и приведенные клинические наблюдения позволяют утверждать, что факторы роста фибробластов способствуют заживлению ран и ожогов, что может значительно облегчить лечение травматической и ожоговой болезни и улучшить исходы лечения ранений и термической травмы. В настоящее время факторы роста фибробластов для клинического применения получают путем встраивания гена, кодирующего их синтез, в генотип бактерий. Для этой цели используют, в частности, Escherichia coli [3]. Однако широкое клиническое использование уже известных лекарственных средств, содержащих факторы роста фибробластов, сдерживается сложностью и высокой стоимостью технологии получения фармацевтической субстанции и небольшими, фактически лишь лабораторными объемами ее производства. Очевидно, что поиск новых, более доступных источников факторов роста фибробластов чрезвычайно актуален.

В результате исследований В.И. Никитенко [6] в культуральной жидкости бактерий Bacillus subtilis 804 обнаружен и получен ранее неизвестный фактор роста фибробластов, обладающий способностью усиливать рост фибробластов in vitro. Этот фактор является комплексом 4 белков с молекулярной массой от 11 до 14 кДа. В отличие от известных факторов он термостабилен, его инактивация наступает при 128 °С. При применении нового фактора роста фибробластов в дозе 1 нг/мл во время экспериментальной аутодермопластики отмечены уменьшение капиллярного кровотечения в период первой сосудисто-эндотелиальной фазы, побледнение грануляций, быстрая, в течение 1-5 мин, фиксация кожных трансплантатов и полное их приживление [5]. Технология получения оригинального ростового фактора довольно проста, легко воспроизводима и не требует больших материальных затрат.

Данные литературы свидетельствуют, что факторы роста фибробластов позволят создать группу оригинальных лекарственных препаратов, стимулирующих регенераторные процессы. Очень перспективно направление по разработке принципиально новых гемостатиков на их основе.

Читайте также: